NF-κBp65特异性siRNA重组腺病毒载体的构建

 

                 陈连旭 于长隆 敖英芳 余家阔 崔国庆 王健全

                 北京大学运动医学研究所（北京100191）

 北京大学第三医院运动医学科陈连旭

摘要  目的：构建核因子-κB（NF-κB）p65特异性小干涉核糖核酸（small interference RNA，siRNA）重组腺病毒载体。方法：设计特异性NF-κBp65 siRNA的靶序列对应的双链DNA，插入腺病毒穿梭质粒，然后跟腺病毒骨架质粒共转染HEK-293A细胞，穿梭质粒和骨架质粒在细胞内整合包装重组腺病毒并用β?Gal染色鉴定。重组腺病毒扩增、纯化、滴度测定后，感染培养的大鼠关节软骨细胞，应用RT-PCR在mRNA水平观察NF-κBp65的表达。结果：β?Gal染色显示重组腺病毒载体构建成功，RT-PCR结果显示重组腺病毒有效抑制了目的基因NF-κBp65的表达。结论：特异性NF-κBp65 siRNA的重组腺病载体可以抑制目的基因的表达，可以用于体内抑制骨关节炎的实验研究。

关键词  NF-κBp65；siRNA；腺病毒；软骨细胞；RT-PCR

 

Construction of Recombination Adenovirus expressing NF-κBp65-Specific siRNA

Chen Lianxu, Yu Changlong, Ao Yingfang, Yu Jiakuo, Cui Guoqing, Wang Jianquan

       The Institute of Sports Medicine, Beijing University, Beijing, China 100191

Abstract  Objective  To construct the recombination adenovirus that express NF-κBp65- Specific siRNA. Methods  DNA oligonucleotides encoded a hairpin siRNA template that targeted NF-κBp65 was designed and ligated into shuttle plasmid, the shuttle plasmid and adenoviral backbone plasmid were co-transfected into HEK-293A cells, the recombination adenovirus was packaged and identified with staining of β?Gal. After expanded, purified and viral title determined, the recombination adenovirus infected articular chondrocytes, the expression of NF-κBp65 in chondrocytes at level of mRNA was observed with RT-PCR. Results  Staining of β?Gal indicated that the recombination adenovirus was successfully packaged, results of RT-PCR indicated that adenovirus could inhibit the expression of NF-κBp65. Conclusion the recombination adenovirus expressing NF-κBp65- Specific siRNA can inhibit the expression of NF-κBp65, and the recombination adenovirus can use to make experimental study of osteoarthritis in vivo.

Key words  NF-κBp65; siRNA; adenovirus; chondrocyte; RT-PCR

 

转录因子核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是介导许多免疫和炎症反应的中心物质，它主要是通过调节一系列参与免疫、炎症反应的基因转录来发挥作用的^[1,2,3]。在关节炎的研究中，白细胞介素-1β（interleukin-κB，IL-1β）在破坏软骨损伤和软骨修复的平衡的过程中发挥重要作用。IL-1β主要通过NF-κB的转录途径，诱导炎性酶--环氧合酶-2和一氧化氮合成酶-2的表达，导致关节内前列腺素和一氧化氮的增加，二者作用于软骨和滑膜，造成软骨破坏和滑膜炎症，引起关节的肿胀和疼痛^[4,5]。因此有必要研究抑制NF-κB的转录活性来阻断IL-1β作用，进行骨关节炎基因治疗的实验研究。我们已经在大鼠关节软骨细胞中筛选出有效抑制NF-κBp65的表达和NF-κB转录活性的siRNA (small interference RNA)，并能有效抑制其下游细胞因子的表达 ^[6,7]。本实验是在体外构建NF-κBp65特异性siRNA重组腺病毒载体，为下一步应用于体内，进行基因治疗骨关节炎的实验研究创造条件。

1 材料和方法

1．1材料、试剂和仪器

健康雄性S-D大鼠，体重250－300克左右，由北京大学科学动物部提供。

NF-κBp65引物由自己设计，北京奥科生物技术公司合成。T4DNA连接酶购自inyitrogen公司，XhoI、SpeI和PacI内切酶购自Takara公司，DMEM细胞培养基购自Gibco公司，胎牛血清由购自Hyclone公司。Trizol试剂盒为Qiagen公司产品；RT-PCR试剂盒为Promega公司产品；The pSilencer^TM adeno1.0-CMV system由Ambion公司提供；BD Adeno-X^TM Virus Purification Kits由Biosciences公司提供。其他试剂均为市售分析纯级以上产品。

紫外可见分光光度仪、DU530蛋白核酸分析仪（德国Beckman公司），凝胶成像分析系统（英国Unitech 公司），PCP仪（德国百瑞公司），电泳系统（美国BIO-RAD公司），高速冷冻离心机（美国SORVALL公司），MCo-15AC CO2培养箱（日本三洋公司），倒置显微镜（日本Olympus公司）。

1．2 方法

1．2．1  发卡样siRNA 寡核苷酸模板的设计

    根据我们以前的研究，特异性NF-κBp65 siRNA的靶序列为5＇-AAGAGCATCATGAA GAAGAGT -3＇^[6]。根据Ambion公司提供的网上设计工具，设计出模板DNA序列分别为：

5＇-TCGAGGAGCATCATGAAGAAGAGTTTCAAGAGAACTCTTCTTCATGATGCTCTTA-3＇5＇-CTAGTAAGAGCATCATGAAGAAGAGT TCTCTTGAA CTCTTCTTCATGATGCTCC-3＇

由奥科生物科技公司合成。经检索，其模板序列内无XhoI、SpeI、 EcoRI、 HindIII和 PacI等内切酶酶切序列。

1．2．2 重组腺病毒的构建

    应用The pSilencer^TM adeno1.0-CMV system进行重组腺病毒的构建。将模板寡核苷酸溶入大约100µl无核酸酶水，稀释成1µg/µl溶液。在50µl的反应体系中，加热到90℃3分钟，然后冷却到37℃，在37℃孵育1小时，将模板寡核苷酸退火成双链。在15µl反应体系中，16℃下，应用T4DNA连接酶连接过夜，将双链寡核苷酸与穿梭质粒连接。5µl连接产物转化DH5_α，铺板，37℃培养过夜。挑选阳性克隆、扩增、提取质粒DNA、XhoI和SpeI酶切鉴定并测序。应用内切酶PacI将上述穿梭质粒和骨架质粒酶切线性化，应用磷酸钙共转染培养的HEK-293 细胞，培养一周，观察腺病毒噬斑。当60％的细胞感染脱离瓶壁时，收获细胞。利用收获的细胞裂解液，原始扩增腺病毒。

1．2．3 重组腺病毒的扩增

    将1.2 x10⁷ HEK-293细胞转移到150mm培养皿中，培养24小时，使细胞达60％融合。将1ml 含有病毒的细胞裂解液加入到75ml 2％血清的培养基中，轻轻旋转颠倒混匀。吸出培养皿中的培养液，加入上述液体15ml，培养24小时。24小时之后，观察病毒噬斑，当有60％的细胞感染后收集细胞。

1．2．4  重组腺病毒的收获和纯化

    将细胞和培养基转移到EP管，2000 rpm离心10分钟；用1 x PBS重悬，2000 rpm离心5分钟，小心吸出上清；用10mM Tris (PH 8.1) 重悬。在干冰或酒精浴中冷冻，37℃溶解，反复三次；12000 rpm离心30分钟；将上清移至新鲜的试管。应用BD Adeno-X^TM Virus Purification Kits系统进行病毒纯化，纯化的病毒液在?70℃储存备用。

1．2．5 重组腺病毒滴度测定

    将5×10⁵的HEK-293细胞转移至6孔板中，培养24小时。将纯化的病毒上清在2％FBS的培养基中稀释为10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11pt/ml的浓度。将培养孔中的培养基吸去，加入1ml上述稀释液，再加入2ml 2％FBS的培养基，总体积为3ml。在培养箱中培养6天，观察病毒噬斑，为了更好的观察噬斑，可行β?Gal染色后观察。

1．2．6  β- Gal染色

   感染的细胞培养72小时后，移去培养基，用PBS冲洗干净。吸净PBS，每孔加入0.5ml 1%的甲醛固定液，室温固定15分钟。用1ml PBS 洗脱细胞三次，加入1ml β?Gal试剂。37℃ 培养，直至蓝色出现。镜下观察并计数蓝色斑点。

1．2．7 原代软骨细胞培养和病毒感染

关节软骨取自S-D大鼠的膝关节和髋关节，利用酶消化法游离软骨细胞，加入DMEM +10%胎牛血清＋双抗在37℃、5％CO₂条件下培养，100％融合后，胰酶消化，转种于24孔培养板中，每孔细胞数为1×10⁵个。培养三天后，重组腺病毒分别以0，10，50，100和200MOI感染细胞48小时，1%甲醛固定15分钟，PBS冲洗，β?Gal试剂染色，镜下观察并计数，计算感染率。重组腺病毒以100 MOI感染细胞72小时，收集细胞，提取mRNA。

1．2．8  mRNA提取和分析

根据试剂盒提供的操作规范，利用Trizol试剂提取RNA，一步法RT-PCR试剂进行逆转录和扩增。条件如下：25µl反应体系，94℃预变性3分钟,94℃变性45秒，60℃退火45秒，68℃延伸45秒，35个循环，72℃延伸10分钟，扩增长度为243bp。NF-κBp65的引物序列为：5＇-TCACCAAAGACCCACCTC ACCG-3＇和5＇-GGACCGCATTCAAGTCATAGTCCC-3＇。PCR产物经1％凝胶电泳、EB染色，经凝胶成像分析仪成像。

2 结果

2．1  The pSilencer^TM adeno1.0-CMV system系统穿梭质粒为环状质粒，大小5891bp，带有CMV启动子，氨苄青霉素抗性，插入片段位于XhoI和SpeI酶切位点之间（图1）。

         

               

 图1  穿梭质粒结构示意图（引自The pSilencer^TM adeno1.0-CMV system 操作规范说明书）

 Fig.1 constructive schematic diagram of shuttle plasmid (Cited from The pSilencer^TM adeno1.0-CMV system--Instruction Manual)

 

2．2 重组穿梭质粒酶切结果和测序结果

重组穿梭质粒扩增后，提取质粒DNA，应用XhoI和SpeI限制酶酶切，0.8%的琼脂糖电泳分析，线性化的质粒位于5890bp（Lane2-7），未酶切的质粒位于5000bp（lane1）。插入片段57bp的条带已跑出凝胶之外（图2）。说明重组成功。DNA测序示插入序列为顺行插入，DNA序列正确（测序结果略）。

     

            图2  XhoI和SpeI酶切鉴定重组穿梭质粒

Fig.2 Identification of recombination shuttle plasmid by digested with XhoI and SpeI.

 

2．3  HEK-293A细胞的β- Gal染色结果

     由于腺病毒骨架质粒中含有LacZ基因，当穿梭质粒和骨架质粒共转染HEK-293A细胞后，进行β-Gal染色，有蓝色的彗星样噬斑形成，表明重组腺病毒包装成功并感染HEK-293A细胞（图3）。

                  

             图3   HEK-293A细胞感染重组腺病毒后β- Gal染色(×400)

Fig. 3  The staining of β- Gal of adenovirus foci in HEK-293A cells (×400)

2．4  纯化重组腺病毒的滴度和感染率测定

    在培养的HEK-293A细胞中测定纯化重组腺病毒的滴度为8×10⁸ pfu/ml。在培养的软骨细胞中测定重组腺病毒的感染率，在0、10、50、100和200MOI时的感染率分别为0、16.38±1.98、67.45±7.63、93.5±8.56和98.21±7.52，选定100MOI进行后续实验。

2．5  重组腺病毒的RNAi功能测试

     培养的软骨细胞感染重组腺病毒（100MOI）后，提取mRNA，利用NF-κBp65的特异性引物进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示，重组腺病毒可以有效抑制目的基因的表达（图4）。

     

               

               图4 重组腺病毒对软骨细胞中NF-κBp65表达的影响。

                   泳道1-4：感染重组腺病毒，泳道5-8：阴性对照。

    Fig.4  The effect of recombination adenovirus on the expression of NF-κBp65 in chondrocytes. Lanes 1-4: infection with recombination adenovirus and lanes 5-8: control.

 

3 讨论

    RNA干扰是近来分子生物学、细胞生物学和遗传学的研究热点。研究转基因植物时发现的共抑制现象，在酵母菌和线虫研究中发现的缓解现象，以及后来所谓的转录后基因沉默 ^[8]，都存在由双链RNA介导mRNA降解的共同机制?-在生物体内，当外源性或内源性双链RNA（double-stranded RNA dsRNA）进入细胞后，识别含有其互补序列的RNA并与之结合后，在酶的作用下降解mRNA，从而干扰相应基因表达。Fire^[9]将这一现象称为RNAi。这是一种广泛存在于生物界的古老的现象，早在动植物分化之前的生物体内就已经产生了。RNAi在生物抵御病毒感染，维持基因组中转座子的稳定以及某些生物生殖细胞的发育过程中都起着重要作用。

随着研究的深入，科学家对于RNAi的发生机制已达成共识：外源性（如病毒）或内源性的dsRNA在细胞内与一种RNA酶3（RNAase 3 endonucleasee）?Dicer结合，随即被切割成21-23 nt的，带有3’端单链尾巴及磷酸化的5’端的21-23 nt的短链dsRNA，是RNAi的起始诱导物，即siRNA。 siRNA与Dicer形成RISC复合体（RNA induced silencing complex)。siRNA作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RISC复合体结合mRNA。随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶Dicer将mRNA切割成21-23 nt的片段，特异性地抑制靶基因的表达。而新产生的双链RNA片段可再次形成RISC复合体，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。因此，每个细胞只需要几个siRNA分子就能够引起强烈的RNAi效应^[10]。

RNAi技术已成为生物基因功能研究有力工具。在哺乳动物细胞中，超过30nt的dsRNA会启动一种自身细胞毒机制，使大量mRNA非特异性降解，引起细胞死亡。为了克服这一障碍，试验人员将体外合成含有19个碱基对和2-3 nt的3’端单链尾巴的短链siRNA，通过脂质体转染，导入哺乳动物细胞后，成功诱导RNAi。但在某些细胞中只能对靶基因产生瞬时抑制效应^[11]。于是学者们构建了以DNA为模板的siRNA表达载体。将19nt的目的序列及其反向重复序列插入含有启动子质粒染色体，同时插入作为检测标志的报告基因如GFP和/或LacZ等。表达载体转染细胞后，能够转录出含有19个碱基对的茎环状（发夹状）siRNA，诱导RNAi，有效抑制目的基因^[12]。表达载体将合成siRNA的过程转移至细胞内进行，不但效率大大提高，而且可以排除RNA酶的干扰，延长siRNA的半衰期^[13]。更重要的，随着载体质粒的复制、扩增，siRNA扩散到整个机体，基因抑制效果能够传代。这一方法的应用，使siRNA技术应用进入了新阶段^[14,15,16]。

本实验就是利用了腺病毒作为表达载体，将特异性NF-κBp65 siRNA的靶序列对应的双链DNA插入其穿梭质粒，然后跟腺病毒骨架质粒共转染HEK-293A细胞，穿梭质粒和骨架质粒在细胞内整合，成功构建包括目的基因片段的重组腺病毒。重组腺病毒感染培养的软骨细胞，可以持续在细胞内转录siRNA，诱导RNAi，特异性抑制目的基因NF-κBp65的表达。下一步工作是应用该重组腺病毒进行动物体内抑制骨关节炎发生发展的实验研究。

 

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