NF-κBp65特异性siRNA的筛选和功能鉴定

 

陈连旭  傅欣 王海军 林霖 魏学磊 张继英 于长隆

北京大学运动医学研究所（北京100083）

 

摘要  目的： 筛选有效的核因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）p65特异性小干扰核糖核酸（small interfering RNA，siRNA），优化反应条件，用来抑制白细胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）诱导的软骨细胞中一氧化氮合酶-2（nitric oxide synthase-2, NOS-2）和环氧合酶-2（cyclooxyge- nase-2, COX-2）的表达，探讨siRNA技术在关节炎治疗方面的应用。方法： 体外转录合成NF-κBp65特异性siRNA，质脂体转染软骨细胞，筛选出有效的siRNA。将筛选的siRNA转染培养的软骨细胞，再用IL-1β刺激诱导软骨细胞，提取蛋白质和RNA。利用RT-PCR和Western blot从mRNA和蛋白质两水平检测NF-κBp65、NOS-2和COX-2的表达，凝胶电泳迁移率分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）测定NF-κB的活性。 结果： NF-κBp65特异性siRNA有效干扰NF-κBp65的表达，降低NF-κB的活性，抑制IL-1β诱导的NOS-2和COX-2的表达。结论：NF-κBp65特异性siRNA可用于关节炎治疗的实验研究。北京大学第三医院运动医学科陈连旭

关键词  NF-κBp65；siRNA；IL-1β；软骨细胞；NOS-2；COX-2