《现代生物医学进展》2010-骨肉瘤中抗OPN抗体与化疗药物联合应用的实验研究

 

商冠宁^1，2 吕刚² 孙平¹ 邢浩¹ 郑珂¹ 王玉名¹ 王巍¹

1， 辽宁省肿瘤医院骨软组织肿瘤科，辽宁 沈阳 110042

2， 中国医科大学附属一院骨科，辽宁 沈阳 110003辽宁省肿瘤医院骨软组织肿瘤科商冠宁

 

【摘要】 目的：通过抗OPN特异性抗体联合化疗药物作用于骨肉瘤MG-63细胞系，验证抗OPN特异性抗体治疗骨肉瘤的有效性及协同化疗药作用的可能性。方法：选用MTX、ADM、DDP、IFO、VP16、紫杉醇6种药物，应用抗OPN特异性抗体与化疗药物联合作用于骨肉瘤MG-63细胞株，加入不同浓度梯度化疗药物，分别在加药后0、24、48、72小时用MTT方法测定吸光值。分析抗OPN特异性抗体治疗骨肉瘤的有效性及与化疗药物的协同作用。结果：MTT实验结果显示，在抗OPN特异性抗体作用于MG-63细胞后，化疗药物对MG-63细胞增殖抑制作用增强，具有明显的剂量依赖性和时间依赖性。并且在化疗药物一定的浓度及时间点下所检测的吸光值显示，抗OPN特异性抗体干扰与否，化疗药物的增殖抑制作用具有显著性差异，说明抗OPN特异性抗体作用下化疗药物对MG-63细胞的敏感性提高。提示抗OPN特异性抗体与化疗药物联合治疗骨肉瘤具有有效性及协同作用。结论：抗OPN特异性抗体通过下调OPN，对MG-63细胞系提高对化疗药物的敏感性有协同作用，可以成为骨肉瘤药物治疗中的一个靶点，但机制尚须进一步研究。抗OPN特异性抗体作为骨肉瘤转移的新的治疗途径，具有广泛的潜在的临床应用价值。

【关键词】 骨肉瘤；OPN；转移；抗体；化疗敏感性

 

新辅助化疗在骨肉瘤治疗中地位的确立，但是目前仍有10%～25%的骨肉瘤患者对现行化疗方案反应差，根本原因可能瘤细胞对化疗药物的耐药性。如何提高术前化疗完全有效的患者比例，加强术前化疗的剂量强度，以及早期识别疗效差的患者，并适当变更原有的治疗方案，是目前骨肉瘤治疗中急待解决的问题。开发新的化疗药物和开展备受关注的基因治疗,成为进一步提高骨肉瘤预后的根本所在。本研究选用六种针对骨肉瘤的常用化疗药物对抗OPN特异性抗体处理前后的骨肉瘤MG-63细胞系进行干预，比较其化疗敏感性，从而推测抗OPN特异性抗体能否成为化疗药物联合治疗的靶点。

1  材料和方法

1.1  细胞系与主要试剂

人骨肉瘤MG-63细胞系由中科院上海细胞生物研究所提供。RPMI-1640培养基购自美国Cellgro公司；10%标准小牛血清购自天津血液病研究所；0.25％胰蛋白酶、抗OPN特异性抗体、四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司。实验用化疗药物甲氨喋呤（MTX）、异环磷酰胺（IFO）、足叶乙甙（VP16）购自江苏恒瑞；阿霉素（ADM）购自浙江海正；顺铂（DDP）购自齐鲁制药；紫杉醇购自哈尔滨三联药业；余实验试剂同前。

1.2  方法

1.2.1  细胞培养

人骨肉瘤MG-63细胞系贴壁生长在含有10％标准胎牛血清、青霉素100000U/L、链霉素100mg/L的RPMI-1640培养液中。在37℃、5％CO₂及饱和湿度的恒温密闭培养箱内传代培养，0.25％胰蛋白酶消化，每2～3天消化一次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2  实验分组及药物处理

对照组：MG-63细胞株，化疗药物处理；实验组：MG-63细胞株，抗OPN特异性抗体+化疗药物处理。试验药均以100倍浓缩液作贮备液，根据不同药物可以用生理盐水、平衡盐液、葡萄糖盐水溶解和稀释，不同的药物贮备液应妥善保存在适合的环境和条件下，有的需暗藏，有的需低温保存。体外药物敏感性试验所用的药物浓度为临床血浆高峰浓度的0.25、0.5、1、2、4倍的剂量，具体浓度见表1，依据下述公式推算：试验药物浓度(mg/ml)= mg×平均体表面积/平均体重×100/60。

表1，化疗药物浓度分组

	浓度1	浓度2	浓度3	浓度4	浓度5
MTX（mg/ml）	1.5	3	6	12	24
ADM（ug/ml）	10	20	40	80	160
DDP（ug/ml）	7.5	15	30	60	120
IFO（mg/ml）	0.45	0.9	1.8	3.6	7.2
VP16（ug/ml）	15	30	60	120	240
紫杉醇（ug/ml）	22.5	45	90	180	360

实验组加入10ug/ml的抗OPN特异性抗体处理24小时后，与对照组加入相同浓度化疗药物，作用24、48、72小时后，分别用MTT法测定细胞活性，记录吸光值。

1.2.3  MTT检测化疗药物敏感性

将5mgMTT溶于1ml培养液，0.22ul滤膜过滤，4度保存待用；检测前吸干培养液，每孔加入200ul新鲜培养液，再加入20ulMTT储存液，摇匀后继续培养4小时；吸干反应液，每孔加入150ul DMSO；将平板置于微控振荡器上振荡10分钟，是洁净无充分溶解；在酶标仪490nm波长测吸光值，DMSO作为阴性对照。分别取0、24、48、72小时作为检测点。

1.3  统计学分析

所有数据均利用SPSS16.0统计学软件处理分析。数据以 ±s表示，两组间比较采用t检验，P<0.05和P<0.01分别表示差异显著和非常显著，P>0.05无统计学意义。

2 结果

2.1  MTX对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

未加药时，OPN对照组和实验组并未显示出统计学差异；在24小时点，有四个浓度点（2、3、4、5）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在48小时点，有二个浓度点（2、3、）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在72小时点，未呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强。本结果提示，OPN干扰与MTX对骨肉瘤细胞MG-63有一定的联合抑制肿瘤细胞增殖的作用，见表2和图1。

表2，MTX对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

浓度	0h	24h	48h	72h
MTX_1
对照组	0.913±0.032	0.576±0.005	0.436±0.003	0.325±0.008
实验组	0.908±0.031	0.567±0.007	0.425±0.007	0.315±0.004
MTX_2
对照组	0.913±0.032	0.546±0.006**	0.332±0.006**	0.209±0.006
实验组	0.908±0.031	0.460±0.002	0.293±0.005	0.205±0.010
MTX_3
对照组	0.913±0.032	0.503±0.054*	0.232±0.005**	0.123±0.005
实验组	0.908±0.031	0.334±0.005	0.164±0.006	0.113±0.005
MTX_4
对照组	0.913±0.032	0.386±0.110*	0.204±0.007	0.100±0.005
实验组	0.908±0.031	0.216±0.110	0.202±0.004	0.103±0.006
MTX_5
对照组	0.913±0.032	0.198±0.008*	0.135±0.009	0.092±0.004
实验组	0.908±0.031	0.176±0.009	0.153±0.055	0.077±0.008

注：*，P<0.05； **，P<0.01

2.2  ADM对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

未加药时，OPN对照组和实验组并未显示出统计学差异；在24小时点，有三个浓度点（2、3、4）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在48小时点，有三个浓度点（2、3、4）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在72小时点，有三个浓度点（1、2、3）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强。本结果提示，OPN干扰与MTX对骨肉瘤细胞MG-63有一定的联合抑制肿瘤细胞增殖的作用，见表3和图2。

表3，ADM对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

浓度	0h	24h	48h	72h
ADM_1
对照组	0.913±0.032	0.573±0.002	0.438±0.004	0.315±0.003*
实验组	0.908±0.031	0.570±0.002	0.435±0.005	0.308±0.003
ADM_2
对照组	0.913±0.032	0.527±0.008*	0.309±0.007**	0.182±0.004**
实验组	0.908±0.031	0.510±0.006	0.271±0.004	0.154±0.010
ADM_3
对照组	0.913±0.032	0.517±0.012**	0.275±0.008**	0.119±0.005*
实验组	0.908±0.031	0.397±0.013	0.178±0.010	0.097±0.007
ADM_4
对照组	0.913±0.032	0.413±0.008*	0.229±0.012*	0.102±0.007
实验组	0.908±0.031	0.317±0.010	0.158±0.006	0.095±0.007
ADM_5
对照组	0.913±0.032	0.175±0.008	0.123±0.011	0.078±0.006
实验组	0.908±0.031	0.167±0.009	0.103±0.008	0.069±0.002

注：*，P<0.05； **，P<0.01

2.3  DDP对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

未加药时，OPN对照组和实验组并未显示出统计学差异；在24小时点，有三个浓度点（2、4、5）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在48小时点，有二个浓度点（2、4）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在72小时点，有一个浓度点（2）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强。本结果提示，OPN干扰与DDP对骨肉瘤细胞MG-63有一定的联合抑制肿瘤细胞增殖的作用，见表4和图3。

表4，DDP对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

浓度	Oh	24h	48h	72h
DDP_1
对照组	0.913±0.032	0.653±0.009	0.529±0.006	0.261±0.002
实验组	0.908±0.031	0.648±0.004	0.522±0.010	0.258±0.002
DDP_2
对照组	0.913±0.032	0.543±0.005*	0.369±0.004**	0.247±0.004**
实验组	0.908±0.031	0.525±0.009	0.348±0.004	0.221±0.008
DDP_3
对照组	0.913±0.032	0.537±0.006	0.257±0.006	0.187±0.010
实验组	0.908±0.031	0.533±0.007	0.250±0.005	0.176±0.009
DDP_4
对照组	0.913±0.032	0.533±0.008**	0.212±0.004**	0.133±0.007
实验组	0.908±0.031	0.397±0.013	0.135±0.009	0.132±0.004
DDP_5
对照组	0.913±0.032	0.315±0.009**	0.164±0.009	0.085±0.009
实验组	0.908±0.031	0.265±0.006	0.145±0.010	0.087±0.010

注：*，P<0.05； **，P<0.01

2.4  IFO对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

未加药时，OPN对照组和实验组并未显示出统计学差异；在24小时点，有三个浓度点（3、4）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在48小时点，有二个浓度点（3、4）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在72小时点，有一个浓度点（5）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强。本结果提示，OPN干扰与IFO对骨肉瘤细胞MG-63有一定的联合抑制肿瘤细胞增殖的作用，见表5和图4。

表5，IFO对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

浓度	0h	24h	48h	72h
IFO_1
对照组	0.913±0.032	0.585±0.010	0.430±0.008	0.327±0.010
实验组	0.908±0.031	0.584±0.009	0.425±0.007	0.325±0.007
IFO_2
对照组	0.913±0.032	0.544±0.009	0.313±0.005	0.204±0.006
实验组	0.908±0.031	0.531±0.006	0.309±0.008	0.187±0.016
IFO_3
对照组	0.913±0.032	0.485±0.010**	0.235±0.010**	0.159±0.007
实验组	0.908±0.031	0.427±0.011	0.196±0.010	0.143±0.008
IFO_4
对照组	0.913±0.032	0.420±0.005**	0.186±0.007**	0.129±0.004
实验组	0.908±0.031	0.338±0.016	0.153±0.006	0.070±0.051
IFO_5
对照组	0.913±0.032	0.259±0.005	0.155±0.009	0.085±0.009*
实验组	0.908±0.031	0.267±0.009	0.160±0.014	0.057±0.008

注：*，P<0.05； **，P<0.01

2.5  VP16对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

未加药时，OPN对照组和实验组并未显示出统计学差异；在24小时点，有三个浓度点（2、3、4）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在48小时点，有三个浓度点（2、3、4）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在72小时点，有三个浓度点（1、2、4）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强。本结果提示，OPN干扰与VP16对骨肉瘤细胞MG-63有一定的联合抑制肿瘤细胞增殖的作用，见表6和图5。

表6，VP16对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

浓度	Oh	24h	48h	72h
VP16_1
对照组	0.913±0.032	0.645±0.006	0.609±0.064	0.436±0.001*
实验组	0.908±0.031	0.636±0.014	0.639±0.001	0.406±0.001
VP16_2
对照组	0.913±0.032	0.555±0.001**	0.465±0.007**	0.378±0.009**
实验组	0.908±0.031	0.506±0.007	0.440±0.005	0.326±0.006
VP16_3
对照组	0.913±0.032	0.535±0.007**	0.327±0.006*	0.225±0.011
实验组	0.908±0.031	0.446±0.007	0.312±0.006	0.208±0.010
VP16_4
对照组	0.913±0.032	0.454±0.007**	0.212±0.004**	0.161±0.004**
实验组	0.908±0.031	0.426±0.007	0.190±0.005	0.126±0.013
VP16_5
对照组	0.913±0.032	0.324±0.017	0.145±0.007	0.115±0.009
实验组	0.908±0.031	0.322±0.023	0.135±0.007	0.109±0.016

注：*，P<0.05； **，P<0.01

2.6  紫杉醇对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

未加药时，OPN对照组和实验组并未显示出统计学差异；在24小时点，有三个浓度点（2、3）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在48小时点，未呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强；在72小时点，有一个浓度点（2）呈现实验组较对照组的细胞抑制作用更强。本结果提示，OPN干扰与紫杉醇对骨肉瘤细胞MG-63有一定的联合抑制肿瘤细胞增殖的作用，见表7和图6。

表7，紫杉醇对OPN有无干扰的MG-63细胞作用的比较

浓度	Oh	24h	48h	72h
紫杉醇_1
对照组	0.913±0.032	0.650±0.005	0.576±0.008	0.449±0.006
实验组	0.908±0.031	0.642±0.007	0.572±0.009	0.448±0.010
紫杉醇_2
对照组	0.913±0.032	0.611±0.002*	0.498±0.018	0.281±0.006*
实验组	0.908±0.031	0.582±0.010	0.485±0.011	0.257±0.008
紫杉醇_3
对照组	0.913±0.032	0.466±0.008*	0.355±0.019	0.239±0.008
实验组	0.908±0.031	0.438±0.012	0.325±0.005	0.228±0.010
紫杉醇_4
对照组	0.913±0.032	0.325±0.009	0.207±0.006	0.130±0.004
实验组	0.908±0.031	0.314±0.006	0.211±0.005	0.126±0.012
紫杉醇_5
对照组	0.913±0.032	0.236±0.031	0.170±0.003	0.119±0.002
实验组	0.908±0.031	0.237±0.009	0.103±0.048	0.109±0.011

注：*，P<0.05； **，P<0.01

3   讨论

随着Rosn为代表的新辅助化疗的开展，以及对骨肉瘤生物学行为的认识不断深入和采用新辅助化疗加保肢方式的根治性手术等综合性治疗模式，使骨肉瘤患者总的生存率达到了60%以上。尽管如此，仍然有部分患者因为肿瘤对化疗药物不敏感以及化疗过程中耐药性的产生，约20～40%的成骨肉瘤患者出现肺部转移，并且已成为成骨肉瘤患者死亡的最主要原因^[36]。如何提高化疗的有效性成为目前困扰骨肉瘤治疗进展的首要课题。

新辅助化疗治疗骨肉瘤的疗效已经无容置疑，目前国际上常用的化疗方案有COSS-86、COSS-92及Rosen 的T10、T12方案等^{[38] [39]}。MTX、ADM、CDP、IFO成为骨肉瘤化疗最有效的四种化疗药物^{[40] [41] [[42]1[43]}。对于新辅助化疗效差及耐药的病例，有学者开始尝试应用VP16、紫杉醇等二线化疗药物进行化疗。VP16在高转移的尤文肉瘤、PNET等小圆细胞肉瘤化疗中取得了良好的效果；紫杉醇作为由植物提取的新化疗药物，广泛应用于转移乳腺癌等难治性上皮源性恶性肿瘤。但目前研究表明，VP16、紫杉醇并未显示出明显优于经典化疗药物的优势。

近年来，基因靶向治疗在晚期结直肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌方面都凸显了临床优势，但是在骨肉瘤的药物治疗方面无明显进展，急需在临床前进行更多的研究，以寻求潜在的治疗途径和治疗方法。基因治疗目前绝大多数研究仅限于细胞或动物实验。针对HER2蛋白的单克隆抗体赫赛汀目前己在临床实际应用中取得较好的疗效，虽然其单用的治疗效果有限，但与紫杉醇、多西紫杉醇及阿霉素等乳腺癌常用化疗药物均具有协同作用^[431]。继手术、放疗和化疗三大传统模式之后，基因治疗己被公认为治疗恶性肿瘤的第四大模式。基因治疗与化疗的结合，提出了恶性肿瘤治疗的新概念生物化疗。基因化疗是生物治疗与化疗相结合的方法，已成为恶性肿瘤治疗的新模式、新理念。

本实验应用抗OPN特异性抗体与化疗药物共同作用于骨肉瘤MG-63细胞系，探讨两者协同作用。结果显示，在抗OPN抗体作用于MG-63细胞后，化疗药物对MG-63细胞化疗敏感性增强，并且在化疗药物一定的浓度及时间点下所测的吸光值显示，抗OPN抗体干扰与否，化疗药物的增殖抑制作用具有显著性差异，提示抗OPN抗体与化疗药物联合治疗骨肉瘤具有有效性及协同作用。

本研究观察到抗OPN特异性抗体与化疗药物联合应用具有协同作用，其化疗增敏作用提示OPN可能与化疗耐药有关。该结果与Graessmann等在小鼠乳腺癌模型中的研究结果向一致，他们的研究结果显示，OPN介导化疗耐药，该作用与其抑制凋亡下游信号因子caspase-3有关^[44]。

目前已有针对OPN独特的抗原决定簇合成的各种抗体进行抗肿瘤的治疗^[45]。OPN的多克隆抗体在体外实验中能够抑制人前列腺癌细胞的克隆形成。Bautista等报道人OPN单克隆抗体可显著抑制有OPN涂层的培养皿中MDA-MB-435细胞和ras转染的NIH₃T₃细胞的粘附。OPN抗体可使多发性骨髓瘤中的破骨细胞之间的接触完全消失，缩短骨髓瘤细胞的生存时间^[46]。OPN的中和性抗体在体外能有效阻断人类肝细胞肝癌侵袭能力，在体内能阻断HCC的肺转移的发生，提示OPN可能成为HCC转移的潜在治疗靶点^[47]。抗OPN抗体通过下调OPN表达水平，对MG-63细胞系提高对化疗药物的敏感性有协同作用，可以成为骨肉瘤药物治疗中的一个靶点，但机制尚须进一步研究。抗OPN抗体作为骨肉瘤转移的新的治疗途径，具有广泛的潜在的临床应用价值。