浅谈国内支原体培养和鉴定中存在的问题

赵旺胜，柏兵（南京医科大学第一附属医院临床检验中心）

    近几年来，泌尿生殖道的支原体，即解脲脲原体（Ureaplasma Urealyticum, Uu）和人型支原体（M.hominis，Mh）感染，在国内受到了很大的重视，就其流行性和耐药等方面涌现了大量的文献报道。在这些报道中，支原体的分 离培养和鉴定方法均存在着一些问题。其中，尤为突出的就是仅凭肉汤培养基颜色的变化来判断有无支原体生长，而不是根据它们在固体培养基上的典型菌落形态， 这是令人疑惑不解的。我们综合国内外有关文献资料，就肉汤颜色变化与支原体培养阴阳性结论的问题进行探讨，以期得到大家的重视。解放军总医院第一附属医院皮肤科杨宇光

 1　支原体培养特性

   支原体是介于细菌和病毒之间的一类缺乏细胞壁的微生物，能在人工培养基上生长，但营养条件要求较高，需要供给胆固醇和酵母。同时，还要添加10%～20% 小牛血清或马血清。支原体培养基一般有三种，即转运培养基，肉汤增菌培养基和固体琼脂培养基。支原体在液体培养基中的生长量较少（Uu在生长量最大时每毫 升不超过106～107个菌落形成单位），生长后培养期地呈不显著的混浊或呈极浅淡的均匀混浊。而在固体琼脂培养基上孵育2～3d后，低倍镜下可见直径约 50～500μm大小的菌落。

   目前，从人类泌尿生殖道中分离出的支原体有5种。其中分离率较高、致病性较强的主要是Uu、Mh。支原体中唯有Uu在生长过程中需要分解尿素，Mh在泌尿 生殖道分解精氨酸的支原体中最常见，所有国内外商品化的支原体肉汤培养基都是根据这个原理设计的。即在Uu和Mh肉汤培养基中分别加入尿素和精氨酸，同时 都加入了酚红指示剂。当尿素或精氨酸被利用分解时产生NH3，肉汤颜色变化，初步提示，肉汤中可能含有Uu或Mh。但是，这仅仅是分离培养支原体过程的第 一步。完整的支原体分离培养过程应有两部分，第一步是肉汤增菌，观察颜色变化，第二步是将增菌培养物再转种琼脂固体培养基孵育，观察其典型菌落形态。最终 准确可靠的鉴定，应当依据其菌落形态和有关生化反应。肉汤颜色的变化还不能完全断定支原体培养是否阳性。

   2　国内外培养支原体规范方法

    2.1 从上个世纪60年代开始至今，欧美就从支原体的生物学特征、培养、药敏等展开了广泛深入的研究。追根溯源，从支原体培养的最初研究开始，支原体的鉴定就是 依据琼脂固体培养基上的典型菌落形态和生化反应，而不仅仅是肉汤颜色的变化。直到现在，在国外所发表的文献中，尚未发现仅凭颜色变化，就直接得出Mh或 Uu培养阳性结论的。在美国，无论第七版的《Mannual of Clinical Microbiology》（临床微生物学手册），还是《Methods in Mycoplasmology》(支原体学方法)，其中都明确提到，支原体的分离培养都包括肉汤增菌和转种固体平板。虽然肉汤颜色的变化在一定程度上已经 提示了支原体培养可能为阳性，但是仍然存在着假阳性问题。

    2.2 国内相关权威性专业书籍中，所介绍的支原体培养方法都同样包括肉汤增菌和转种固体平板两部分。如1997年《全国临床检验操作规程》（第二版），和曹玉璞 主编的《支原体与支原体病》（2000年版），以及2003年中华医学会检验分会临床微生物学组编写的《临床微生物学操作规范》（暂行稿），对Uu和Mh 的培养方法都有详细介绍和明确规定。《临床微生物学操作规范》（暂行稿）是这样要求的：将标本分别接种10B肉汤和A8琼脂平板，接种后的肉汤每天2次观 察颜色变化，第1～4d出现由黄变红改变时，检查原种的琼脂平板是否有菌落生长，如果没有，立即转种变色的肉汤至琼脂平板。琼脂平板在接种后的第1～3d 出现的圆形棕色菌落，直径在15～60μm，判断为Uu；若接种第3～4d出现油煎蛋样菌落，直径为200～300μm，判断为Mh。因此，目前无论是国 外，还是国内的规范方法，判断支原本阳性的结论最终是建立在固体培养基上的典型支原体菌落，而不是仅靠肉汤颜色变化。肉汤颜色的变化只是一种提示和初筛。

   3　仅凭肉汤颜色变化诊断，可能会导致支原体培养结果的误判

   从国内所发表的众多有关生殖道支原体培养的文献来看，支原体培养都是仅仅看肉汤颜色变红，就报告分离到支原体。这样的结果难免会出现假阳性和假阴性。因为 没有转种固体培养基，肉眼未见支原体菌落形态，就很难保证结果的准确性，实际上肉汤颜色变红可能会有以下几种情况。

  3.1 支原体生长  标本中有Uu或Mh时，肉汤呈红色。

  3.2 细菌污染  一种是当标本中存在能分解尿素或精氨酸的细菌时，可将肉汤颜色变红；还有一种情况是标本中既有支原体，又有细菌同时存在，肉汤颜色变化且浑浊。如果不转种固体培养基分离，前者的结果无疑是假阳性，而后者结果则难以确定。

  3.3 真菌污染  如果标本中有某些酵母菌污染，可引起肉汤颜色变化，但不出现浑浊，这就导致了肉眼无法分辨的假阳性。

  3.4 不分解尿素的支原体  Alison等人在分离女性生殖道支原体时，将标本接种到肉汤中培养过夜后，不管肉汤颜色有无变化，全部接种到平板上，结果有少部分标本出现典型的支原体菌落，但其肉汤在一周内一直没有颜色变化。

   近40多年来，国外在支原本研究的过程中，对支原体培养的污染所导致的假阳性或假阴性有过很多报道。他们对支原体培养都采用肉汤增菌和固体培养基两步培养的方法，使得支原体培养的假阳性和假阴性得到较好的控制。

 4　对支原体培养采用规范方法的建议

  采用观察肉汤颜色变化来进行支原体培养的方法，我们认为缺乏一定的科学依据，未遵循操作规范，是不规范、不严谨的一种做法，与国际公认的方法也不相符，结 果的准确性和可信度值得人们商榷。前一时期，南京某医院就出现过凭肉汤培养基颜色发红而报告有支原体的假阳性结果，导致病原菌上告法院，医院败诉赔钱。因 此，我们建议今后支原体培养还是以肉汤和固体培养基一起接种为好，不能仅凭肉汤颜色变化，而舍弃固体培养基看菌落形态。只有方法的规范和严谨才能有结果的 准确与可信，如果以后再有类似这样的论文投稿，建议各专业刊物不予刊登。请广大读者引起重视。

摘自：《临床检验杂志》2004年第5期