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- 于大君主任医师 博士
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医院:
中国中医科学院西苑医院
科室:
肾病科
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- 益气滋肾颗粒对IgA肾病辅助性T淋巴细胞亚群调节作用研究
- 作者:于大君|发布时间:2009-07-29|浏览量:381次
中国中医研究院西苑医院 于大君① 聂莉芳① 许勇钢② 杨晓红②
摘要 目的:进一步阐明IgA肾病的发病机制以及益气滋肾颗粒对IgA肾病辅助性T淋巴细胞亚群(Th1/Th2)的影响。 方法:应用流式细胞仪分别对31例IgA肾病患者运用益气滋肾颗粒治疗前后和24例健康对照的Th1/ Th2细胞内细胞因子进行了检测。 结果:IgA肾病患者与健康对照比较,IFN-γ水平较低,而IL-4、IL-10水平高,IgA肾病患者存在Th1/Th2的失衡。益气滋肾颗粒治疗后,IFN-γ水平较治疗前升高,IL-10水平较治疗前降低。结论:益气滋肾颗粒对IgA肾病患者的Th1/Th2失衡有一定的调节作用。中国中医科学院西苑医院肾病科于大君
关键词 益气滋肾颗粒 IgA肾病 辅助性T淋巴细胞亚群
Research of the effect of Yiqizishen Granulation on helper T lymphocyte subsets in IgA nephropathy Yu Dajun,Nie Lifang, Xu Yonggang, et al. Xiyuan Hospital, China Academy of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100091, China
Abstract: Objective: To shed light on the pathogenesis of IgA nephropathy(IgAN) and the effect of Yiqizishen Granulation on intracytoplasmic cytokines secreted by helper T lymphocyte subsets (Th1/Th2) in IgAN. Method: we measure intracytoplasmic cytokines secreted by Th1/Th2 of venous blood in 31 IgAN patients before and after treated by Yiqizishen Granulation and 24 healthy controls using flow cytometry. Results: The propotion of IFN-γof IgAN is lower than that of healthy controls. The propotion of IL-4, IL-10 of IgAN patients is higher than that of healthy controls. The abnormity of Th1/Th2 exists in IgAN patients. Conclusion: Yiqizishen Granulation can regulate the abnormity of Th1/Th2 in IgAN patients to some extent.
Key words: Yiqizishen Granulation IgAN helper T lymphocyte subsets (Th1/Th2)
1.研究目的
IgA肾病是最常见的原发性肾小球疾病之一[1],据我国的肾活检资料,IgA肾病占原发性肾小球疾病的38%-49%,居首位[2], 40%以上的患者会发展成终末期肾脏病[3]。因此,探索IgA肾病的发病机制,从而能找到有效的治疗方法,成为近年来肾脏病学界研究的一个重要课题。对IgA肾病发病机制的研究包括多个方面,如遗传因素、IgA分子和IgA受体等。随着1986年辅助性T淋巴细胞亚群(Th1/Th2)的发现,用Th1/Th2细胞的异常可以解释许多自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮,多发性硬化症等[4]。IgA肾病与外来或自身抗原产生的损伤性免疫反应有关,因此,近年来许多研究试图探讨Th1/Th2的失衡在IgA肾病发病中的作用。
聂莉芳教授以益气滋肾法为治则研制的经验方-益气滋肾颗粒在临床已应用多年。临床研究证明益气滋肾颗粒不仅可以改善IgA肾病患者的症状,而且可以减少患者的血尿和蛋白尿[5]。实验研究证实该药有助于清除免疫复合物在肾小球的沉积[6]。为了进一步阐明IgA肾病的发病机制以及益气滋肾颗粒对IgA肾病Th1/Th2的影响,我们应用流式细胞仪分别对31例IgA肾病患者治疗前后和24例健康对照的Th1/ Th2细胞内细胞因子进行了检测,以期揭示益气滋肾颗粒对IgA肾病患者Th1/Th2的调节作用。
2.材料与方法
2.1材料
2.1.1病人: 自2003年2月-2003年12月共收集IgA肾病患者31例,这些患者均经过肾活检确诊。其中男性16例,女性15例,年龄15岁-57岁,平均年龄29.55±9.87岁。治疗前表现为单纯血尿者(24小时尿蛋白定量<0.15g)12人, 血尿伴蛋白尿(尿蛋白0.15-1.0 g )14人, 血尿伴蛋白尿(尿蛋白1.0 -3.5 g)5人。伴高血压者6人,服降压药(包括血管紧张素转换酶抑制剂和/或二氢吡啶类钙拮抗剂)者10人,曾服过强的松(起始剂量30mg)者1人。疾病确诊时间(肾穿刺到检测时间)0.5月-69月,中位数是8个月。不同单位肾活检病理诊断结果为轻度系膜增生者17人,局灶增生硬化者4人,局灶增生者2人,局灶坏死者1人,Lee氏分级Ⅳ级1人,Ⅲ级5人,Ⅱ级1人。治疗前后,31例患者未出现上呼吸道感染、泌尿系感染等病症。患者31例患者均属于气阴两虚证。31例患者服益气滋肾颗粒前后均检测了4个细胞因子,包括由Th1细胞分泌的γ-干扰素(IFN-γ)和白介素-2(IL-2),由Th2细胞分泌的白介素4和白介素10(IL-4、IL-10)。
2.1.2治疗药物、服药方法和疗程:上述患者在观察期间服用益气滋肾颗粒,每次服12g,每天2次,饭后1个半小时服用,疗程为3个月。益气滋肾颗粒由太子参、生黄芪、生地、旱莲草等药物组成,功在益气滋肾、凉血止血。该药由西苑医院制剂室提供。在整个观察期间,患者未用任何其它中西药物。
2.1.3对照:健康对照24人,均排除肾脏疾病。男12人,女12人,年龄26岁-40岁,平均年龄32.17±4.77岁。健康对照也检测了上述4个细胞因子:IFN-γ、IL-2 、IL-4、IL-10。
2.2实验试剂和仪器
2.2.1试剂
2.2.1.1单克隆抗体
细胞膜表面标记抗体:抗人CD4-PC5(mouseIgG1,13B8.2)及同型对照,购自美国Coulter-Immunotech公司。
细胞内细胞因子标记抗体:抗人IL-4-pe(mouseIgG1,4D9),IL-10-fitc(mouseIgG1,8D4-8),抗人IFN-γ-fitc(mouseIgG1к,4S.B3), 抗人IL-2-pe(mouseIgG1к,4S.B3)及同型对照,购自美国DB-PharMingen公司。
2.2.1.2透膜试剂
使用细胞内细胞因子专用试剂盒(IntraPrepTM Permeabilization Reagent),购自美国HyClone公司。
2.2.2仪器
EPICS ELITE型流式细胞仪(美国BECKMAN-COULTER公司)。
2.3方法
2.3.1细胞培养与染色:取300ul抗凝静脉血加入15µLCD4-Pc5单抗,室温避光孵育30分钟,RPMI1640洗涤一次,将细胞加入RPMI1640培养体系中(含新生牛血清10%、青霉素100IU/ml、链霉素100ug /ml、PMA50ng/ml、ionomycin1µg /ml、monensin2µM),37℃,5%CO2,孵育18小时。PBS洗涤一次,用Coulter-Immunotech公司专用细胞内细胞因子试剂进行细胞固定、透膜(按试剂盒说明书),将细胞分成3管,其中第1管同时加入抗人IL-4-pe和IFN-γ-fitc,第二管同时加入抗人IL-2-pe和IL-10-fitc,第三管加入同型对照,室温、避光30分钟,PBS洗涤一次,待测。
2.3.2流式细胞仪测定
打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预热20分钟,同时,仪器自动初始化;用标准荧光微球校正光路和荧光补偿,然后依次检测标本,每份标本检测50000以上细胞;在前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)散点图中圈定淋巴细胞群,然后分析CD4阳性细胞中IL-4-pe、IFN-γ-fitc、IL-2-pe和IL-10-fitc的表达。
2.4 统计方法
健康人与病人的性别比较用X2检验,健康人与病人的年龄、细胞因子指标比较、益气滋肾颗粒治疗前后尿液检查指标和细胞因子比例的比较用T检验。统计软件用SPSS10.1统计分析软件。
3.研究结果
IgA肾病患者组和健康对照组的性别和年龄比较
表1 IgA肾病患者组和健康对照组的性别比较
|
IgA肾病患者 |
健康对照 |
男(例) |
16 |
12 |
女(例) |
15 |
12 |
X2=0.291, P=0.590>0.05,两组间性别无显著性差异,具有可比性。
表2 IgA肾病患者组和健康对照组的年龄比较
|
IgA肾病患者 |
健康人 |
平均年龄( ±SD) |
31.41±4.14 |
32.17±4.77 |
T=-1.474, P=0.145>0.05, 两组年龄之间无显著性差异,具有可比性。
3.1 IgA肾病患者组和健康对照组Th1/ Th2的比较
表3 IgA肾病患者组和健康对照组Th细胞分泌的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10比较
细胞因子 |
组别 |
T值 |
P值 | |
IgA肾病患者组 ( ±SD) |
健康对照组 ( ±SD) | |||
IFN-γ |
24.989±9.903 |
30.779±10.774 |
2.234 |
0.029* |
IL-2 |
47.798±14.483 |
53.387±9.125 |
1.917 |
0.06 |
IL-4 |
2.959±1.271 |
2.238±0.360 |
-3.517 |
0.001** |
IL-10 |
4.498±2.439 |
3.070±0.814 |
-3.493 |
0.001** |
* P<0.05,**<0.01
从上表可以看出,经T检验,IgA肾病患者组和健康对照组的IFN-γ水平,有显著性差异(P<0.05),IL-4、IL-10水平有非常显著性差异(P<0.01),即IgA肾病患者与健康对照比较,IFN-γ水平较低,而IL-4、IL-10水平高,IgA肾病患者存在Th1/Th2的失衡。同时,也可以看出,IL-2水平无显著性差异(P>0.05)。
图1 IgA肾病患者组和健康对照组IFN-γ水平的比较
左图为一IgA肾病患者的IFN-γ水平,右图为一健康对照的IFN-γ水平,H2区为Th细胞中分泌IFN-γ的细胞(Th1)所占的比例,从图中可以看出IgA肾病患者的IFN-γ水平较健康对照者低。
图2 IgA肾病患者组和健康对照组IL-4水平的比较
左图为一IgA肾病患者的IL-4水平,右图为一健康对照者的IL-4水平,D2区为Th 细胞中分泌IL-4的细胞(Th2)所占的比例,从图中可以看出IgA肾病患者的IL-4水平较健康对照者高。
图3 IgA肾病患者组和健康对照组IL-10水平的比较
左图为一IgA肾病患者的IL-10水平,右图为一健康对照者的IL-10水平,E2区为Th 细胞中分泌IL-10的细胞(Th2)所占的比例,从图中可以看出IgA肾病患者的IL-10水平较健康对照者高。
3.2 益气滋肾颗粒对IgA肾病Th1/ Th2的调节作用
表4 益气滋肾颗粒治疗前后IFN-γ、IL-4、IL-10 比较
|
治疗前( ±SD) |
治疗后( ±SD) |
T |
P |
IFN-γ |
24.989±9.903 |
28.660±9.458 |
2.078 |
0.041* |
IL-4 |
2.959±1.271 |
2.231±0.564 |
-1.976 |
0.06 |
IL-10 |
4.498±2.439 |
3.227±0.905 |
-2.923 |
0.001* |
* P<0.05,**<0.01
从上表可以看出, 经T检验,益气滋肾颗粒治疗后较治疗前相比,IFN-γ水平有显著性差异(P<0.05),IL-10水平有非常显著性差异(P<0.01),而IL-4水平无显著性差异(P>0.05),即益气滋肾颗粒治疗后,IFN-γ水平较治疗前升高,IL-10水平较治疗前降低, 益气滋肾颗粒对IgA肾病患者的Th1/Th2失衡有一定的调节作用。
左图为一IgA肾病患者治疗前的IFN-γ水平,右图为该患者治疗后的IFN-γ水平,H2区为Th 细胞中分泌IFN-γ的细胞(Th1)所占的比例,从图中可以看出治疗后比治疗前IFN-γ水平有所升高。
图5 益气滋肾颗粒治疗前后IL-10水平的比较
左图为一IgA肾病患者治疗前的IL-10水平,右图为该患者治疗后的IL-10水平,E2区为Th 细胞中分泌IL-10的细胞(Th2)所占的比例,从图中可以看出治疗后比治疗前IL-10水平有所下降。
4.讨论
4.1即往文献有关于Th1/Th2失衡参与了IgA肾病发生的报道。有的研究者对IgA肾病患者血液中Th1/Th2产生的细胞因子分别进行了测量,结果显示在IgA肾病患者中,IL-2、IFN- γ均较正常对照组低,而IL-4、10均较正常组高[7,8]。本研究显示IgA肾病患者存在Th分泌的细胞因子的异常,即Th1分泌的IFN-γ降低,Th2分泌的IL-4 、IL-10的增高,这一结果与文献报道是一致的。有研究显示Th1/Th2分泌的细胞因子参与了IgA肾病特异的炎症和免疫损伤过程[9]。Th2分泌的细胞因子的增高增加了产生IgA的形式,同时也调整了IgA分子的糖基化形式[10],在可能的这种发病机制下,细胞因子对IgA肾病的产生起了促进作用。
4.2 研究结果显示益气滋肾颗粒不仅可以减少IgA肾病患者的尿红细胞数和24小时尿蛋白定量,而且对Th1/Th2有调节作用,使IFN-γ水平提高,IL-10水平下降,对Th1/Th2的失衡有一定的调节作用,这可能与益气滋肾颗粒的益气滋肾、扶助正气作用有关。方中的太子参、生黄芪有提高机体免疫力的作用[11],益气滋肾颗粒中这些主要成分的作用,可能会对IgA肾病患者的Th1/Th2失衡有一定的调节作用。
参考文献
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11.颜正华: 临床实用中药学 北京:人民卫生出版社 1984
*本课题为国家科技部基础性工作专项资金项目的分课题之一(No.2001DEA20010)
①中国中医研究院西苑医院肾病科
②中国中医研究院西苑医院血液实验室
地址:中国中医研究院西苑医院 北京海淀区西苑操场一号 100091
本论文发表在中国中西医结合杂志2006年9月
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