引物及探针设计原则（刘小丰收集整理）

（刘小丰收集整理，有英文，后面是中文）

1.The design step: the selection of PCR primers and probes

2.Choice of detection method (SYBR Green or a fluoresent nucleic acid probe) for the real time PCR.
Generally, real time PCR with SYBR green is used to optimize primers and is principally used to detect PCR products in a research setting. TaqMan probes and molecular beacons provide further specificity, necessary for diagnostic PCR and also to enable multiplexing and reaction.南京妇幼保健院乳腺科刘小丰

The design of a real-time PCR assay has more parameters than conventional PCR. Computer software is available to aid the design of real time PCR. e.g. Primer Express, and Beacon Designer. These programs include all of the design parameters required.

1.The first step in the design of a PCR is to choose a target region of the gene. If the target sequence contains regions of variability, then a alignment of sequences is necessary to find conserved areas, such as 5"NCR of enteroviruse.

2.When selecting Primers, they should define a 100- to 200-bp amplicon. The melting temperature(Tm) of primers should be 7-10 less than that of the probe in order to achieve probe binding prior to primer binding, which is crucial for the produciton of fluorescence. The best Tm for the primers is 55-60. There are many criteria in the computer programs for optimal primer and probe design. In general ,the primers should be 20-25 bp long and fulfill general PCR requirements of having minimal anti-complementarity sequeces and a maximum of two GCs at the 3" end.

3. Once the primers have been selected, the target sequeces need to be checked for secondary structures at the annealing temperature. This is best performed by putting the whole target sequece into the Mfold/Zuker program(http://www.bioinfo.rpi.edu/~zukerm/rna/) and entering the proposed annealing temperature and reaction conditions. The resulting structure should have little secondary structure and more particularly, no folding where either primers or probe will bind.

4. The probe is designed in a similar way as the primers to fulfill general PCR requirements and to have a Tm 7-10 higher than that of the primer. Molecular beacons have 5- to 7-bp stem sequences attached to the probe. These are GC-rich and, again, should form a stable hairpin structure in the Mfold program using the same parameters for the taarget as described above(www.molecular-beacons.org/). In some cases, a quenching effect of a 5" G in a fluorescent probe has been described. However, initially a 5"G was in the standard stem of molecular beacons, as deduced from one of the first reports of application of molecular beacons, and no problems were encountered.

5.Finally, the primers and probe should have their specificity checked for homology with other sequences using the BLAST program.If significant homology is detected, it may be necessary to redesign the primer pairs.

一、实时荧光Taqman 探针设计
总原则：探针选择要保守，引物选择要保守，因此必须找一段100-200bp相对要保守的片段来设计引物与探针。即real-time PCR的扩增片段是50bp----150bp。当找不到150bp的保守片段时，必须确保探针的片段是保守的。
在设计探针和引物时，要同时考虑在两条链上设计引物与探针。但要注意的是：在那条链上设计探针时，就应靠近在同一条链上设计的引物(即上游引物)。这样，可保证在将来扩增时，即便没有完全扩增，也有荧光信号报告出来。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠。
若在原序列中找不到合适的探针与引物(1主要是探针和上游引物的距离太远，而离下游引物的距离却较近时；2突变位点要求在探针的5’ 端也能检测到荧光信号，但却是在3’端)，可在互补的序列中设计引物与探针。
另real-time PCR中的探针和引物的Tm值，均要高于平常PCR的引物和杂交的探针的Tm值。
二、 探针的设计
探针设计的基本原则：
1． 保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。
2． 探针长度
Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，这样可保证探针在煺火时先于引物与目的片段结合。因此探针最好是富含GC的保守片段，保证其的Tm值较高。现在有Taqman MGB探针，在TAMER之后再标记一个MGB，可使探针的Tm值较高,即使探针片段较短，也可达到Taqman探针的Tm值要求(68-70℃)。

3． 探针的名称
应标记探针在基因组的位置及长度。
4． 探针Tm值计算
用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。确保探针中GC含量在30-80%。应避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。
5． 探针的评价
用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入探针的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的探针序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primer self dimer”,分析探针的二聚体。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个dimer，并对此探针用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析探针的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此探针有多少个hairpins，并对此探针的hairpins进行评价。多重荧光PCR时，要对多条探针进行“pair dimer”进行分析。
6． 探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，G可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
7． Taqman探针与引物之间的位置
Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基，但也可以重叠，要保证Taqman探针的5’端离上游引物的5’端至少有4bp。
如：

forward primer Taqman probe

5’ → 3’ 5’ FAM→3’染料

NNNNNNN NNNNNNN

发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

互补发表序列 3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’
NNNNNNN

3’ ←5’
reverse primer
或：
reverse primer

5’ → 3’
NNNNNNN
发表序列： 5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
互补发表序列 3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’
NNNNNNN NNNNNNN
料染3’ ← MAF5’ 3 ’← 5’
Taqman probe forward primer
Taqman probe forward primer
三 引物的设计

1． 上下游引物要保守

为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守，最好不要有不同的碱基，若不得不有时，也必须保证引物的3’端至少有4个碱基是完全保守才可。

在设计保守引物时，要在发表序列上分别找保守一致的区域，即在发表序列的5’端引物位置找的是3’端至少有5个bp保守，在即在发表序列的3’端引物位置找的是5’端至少有5个bp保守。

5’NNNNNNN 3’

发表序列：5’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’NNNNNNNNN 5’

2． 上下游引物的长度和Tm值

上下游引物的长度一般为18-25bp之间，且Tm值在58-60℃之间。确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。

上游引物应标记F(forword)，且在基因组的位置及长度；下游引物应标记R(reverse)，且在基因组的位置及长度。用oligo或primer preiemer软件即可计算Tm值。上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃，长度相差最好不超过4bp。

3． 引物的评价

用DNAstar软件中的Primerselect软件，点击“log”菜单中的“create primer catalog”，在“name”中输入引物的名称、位置，按Tab键进入“sequence”，粘贴或输入要分析的引物序列。选中整个序列后，在“report”菜单下“primer self dimer”,分析引物的二聚体。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个dimer，并对此引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。在“report”菜单下“primer hairpins”,分析引物的发夹结构。弹出的窗口中就告诉此引物有多少个hairpins，并对此引物的hairpins进行评价。再选择所需要的上下游引物，在“report”菜单下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好(dG值通常为负值)，绝对值超过4.5kcal/mol易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行)。不必考虑引物与探针之间的配对与发夹结构，因为探针的Tm值非常之高。
4． 上下游引物与探针的距离(上下游引物的位置)

理论上讲，上游引物的3’端离探针的5’端为1-20bp，最佳是1bp，最近为上游引物的3’端离探针的3’端为4bp；下游引物要与探针有一定的距离，但要保证下游引物的3’端离探针的3’端最为15-150bp。整个目的片段的长度最好在50-150bp之间，最长不超过200bp。
5． 简并引物的设计

当为了能够同时扩增即使在引物位点也有突变的目的片段，若多个碱基出现的概率相同，就要在此位点，设计一个代表多个碱基的简并子。在合成引物时，在合成到此位点时，就不是加入一个碱基，而是同时加入简并子所代表的多个碱基。这样，实质合成的引物是多条引物，只不过是在简并子位置碱基不同而已。但简并引物要考虑每条引物的Tm值，确保简并子所代表的不同碱基的不同引物Tm值相差不超过2℃。若超过2℃，在确保引物的3’端引物相同时，在Tm值较低的碱基引物的5’端加入几个碱基，使其的Tm值相同。但这时就不是简并引物，而是分别合成长度不同，简并子位点碱基不同，但Tm值相同的两条引物，最后在进行等浓度的混合即可。

5’ → 3’

NNNANNN

NNNGNNN

序列：5’-NNNNNNNNNA/GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

R

R

四、 实时多重PCR探针的选择：

1．多重实时PCR的多种含意有两种：一为选择保守的探针和引物，利用不同的染料标记探针，在检测时可根据荧光的颜色来判定不同的产物。另一种为选择保守的引物，扩增不同长度的目的片段，反应中加入SYBRN染料，最后根据不同目的片段的Tm值来判定不同的物品。

2．多重实时PCR的荧光探针应为同一类型：如同时为Taqman 探针、或同时为MGB探针、或同时为Beacon 探针。

3．MGB探针的优点：
a.MGB探针较短(14-20bp)，更容易找到所有排序序列的较短片段的保守区。
b.短片段探针(14-20bp)加上MGB后，Tm值将提高10℃，更容易达到荧光探针Tm值的要求。

4．MGB探针的设计原则
1)探针的5’端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
2)用primerexpress软件评价Tm值，Tm值应为65-67℃。
3)尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于13bp。
4)尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
5)原则上MGB探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。因此，在进行SNP检测时，为了检测到突变子，即Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段产生荧光信号检测将探针的突变位点尽量放在中间1/3的地方。注意：为了满足上述要求的4个条件，探针的突变位点可向3’端移动，但突变位点至少在离3’端2个碱基的前方(即必须确保探针的后两个碱基是绝对的保守)，以进行SNP检测。反过来，若要进行同类检测，找的是保守片段区，探针中不应有突变位点。若探针即便是只有13个bp,探针仍不完全保守。有几个突变，突变位点也应靠近探针的5’端，这样，即便是突变，探针也可与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计简并探针，也可达到即使是突变，仍可检测到突变。
5.在多重PCR中，多重PCR的各个引物之间相互干扰和各个探针之间相互干扰分析
设计好各对引物和探针后，重新在用DNAstar软件中的Primerselect软件，打开保守在同一文件中的多重PCR的引物文件，然后两两分别选中所设计的多重引物或两两分别选中所设计的多重探针后，在“report”菜单下“primer pair dimers”,分析上下游引物的dimers。弹出的窗口中就告诉此对引物有多少个dimer，并对此对引物用dG值进行评价(通常给出最差的dG值，理论上是dG值越大越好)。
6.多重实时荧光PCR扩增片段影响
最好每重扩增相同长度的目的片段，但长度不以相差太大。
7．同种亚型明显分为几群，而又想同时扩增整个亚型的引物与探针设计策略。
先对各个亚群设计各自保守的引物与探针，然后探针用同一染料标记，这样在实时PCR反应中，虽然是多重PCR反应，但报告却是同一个染料报告。

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