- 如何查找一个基因的启动子序列
- 作者：刘小丰|发布时间：2010-07-24|浏览量：8056次
刘小丰 收集整理
定义：启动子是参与特定基因转录及其调控的DNA序列。包含核心启动子区域和调控区域。核心启动子区域产生基础水平的转录，调控区域能够对不同的环境条件作出应答，对基因的表达水平做出相应的调节。
区域：启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp，有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。南京妇幼保健院乳腺科刘小丰
这项搜寻要从UCSC基因组浏览器开始，网址为http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway。以编码pendrin (PDS)的基因为例来说明上述问题。PDS与耳蜗的异常发育、感觉神经性听力下降以及弥散性甲状腺增大（甲状腺肿）有关。
进入UCSC的主页后，在Organism的下拉菜单中选择Human，然后点击Browser。使用者现在到了人类基因组浏览器入口。本例的搜寻很简单：在assembly的下拉菜单中选择Dec. 2001，在position框中键入pendrin，然后点击Submit。返回的页面结果显示一个已知的基因和两个mRNA序列。继续点击mRNA序列的登录号AF030880，出现包含这个mRNA区域的图解概要。为了获得这个区域更清晰的图像，点击紧靠zoom out的1.5X按钮。最后点击页面中部的reset all按钮，使各个路径的设置恢复默认状态。
然而，对于本例的搜寻目的来说，默认设置不是理想的设置。按照视图利用页面底部的Track Controls按纽，将一些路径设置为hide模式（即不显示），其他设置为dense模式（所有资料密集在一条直线上）；另一些路径设置为full模式（每个特征有一个分开的线条，最多达300）。在考虑这些路径内究竟存在那些资料之前，对这些路径的内容和表现做一个简要的讨论是必要的，许多这些讨论是由外界提供给UCSC的。下面是对基因预测方法的更进一步讨论，这些信息也可以在其他地方找到。
对于Known Genes（已知基因）和预测的基因路径来说，一般的惯例是以一个高的垂直线或块状表示每个编码外显子，以短的垂直线或块状表示5′端和3′端非翻译区。
起连接作用的内含子以非常细的线条表示。翻译的方向由沿着细线的箭头指示。
Known Genes来自LocusLink内的mRNA参照序列，已经利用BLAT程序将这些序列与基因组序列进行比对排列。
Acembly Gene Predictions With Alt-splicing路径是利用Acembly程序将人类mRNA和EST序列数据与人类基因组序列进行比对排列而来的。Acembly程序试图找到mRNA与基因组序列的最好的比对排列以及判断选择性剪接模型。假如有多于1个的基因模型具有统计学意义，则它们都全部显示出来。有关Acembly的更多信息可以在NCBI的网站找到（http://www.ncbi.nih.gov/IEB/Research/Acembly/）。
Ensembl Gene Predictions路径由Ensembl提供。Ensembl基因通过许多方法来预测，包括与已知mRNA和蛋白质进行同源性比较，ab initio基因预测使用GENSCAN和基因预测HMMs。 http://www.ebi.ac.uk/ensembl/ Fgenesh++ Gene Predictions路径通过寻找基因的结构特征来预测基因内部的外显子，例如剪接位点的给位和受位的结构特征，利用一种动态的程序算法推定编码区域和推定外显子5′端和3′端的内含子区域；这个方法也考虑到蛋白质相似性的资料。
Genscan Gene Predictions路径由GENSCAN方法衍生而来，通过这个方法，可以确定内含子、外显子、启动子区域和poly(A)信号。此时，这个方法并不期望查询的序列只出现1个基因，因此可以对部分基因或被基因之间的DNA分隔的多个基因进行准确的预测。
Human mRNAs from Genbank路径显示基因库的人类mRNAs与基因组序列的比对排列。
Spliced ESTs和Human EST路径显示来自GenBank的ESTs序列与基因组的序列对齐比较。由于ESTs通常代表了转录基因的片断，一个EST很有可能对应于某个外显子区。
最后，Repeating Elements by RepeatMasker这个路径显示的是重复元件，例如散在的或长或短的核元素(SINEs和LINEs)，长末端重复序列(LTRs)和低复杂性区域(http://repeatmasker.genome.washington.edu/cgi-bin/RepeatMasker)。一般来说，在将基因预测方法应用于核苷酸序列之前，需要去掉或掩饰这些成分。
回到视图显示的例子，可以看到大多数路径返回了几乎同样的基因预测结果。作为一个规则，通过多种方法预测的外显子提高了预测的正确率而不会出现“假阳性”结果。多数方法显示3′端非翻译区，以左侧大而短的块状表示。Acembly路径显示除了全长序列产物（如这个部分第3条线所示）之外还有3个可能的选择性剪接，其它大多数路径显示与此预测结果相符。Genscan路径从左、右方向往远处延伸：GENSCAN可以被用于预测多个基因。
尽管这些图解概要很有用，然而研究者更需要与这些垂直线或块状相对应的序列。以此为例，用Fgenesh++预测作为获得原始序列数据的基础，但不管选择哪个路径其步骤都是一样的。点击标有Fgenesh++ Gene Predictions的路径，出现的是一个描述预测的概要页面。
序列的区域与pendrin基因相似（从这个例子一开始就已经知道了）。给出了序列的大小及序列开始和结束的预测，并显示预测是以负链为基础的。想要获得序列，点击Genomic Sequence。使用者将被带到一个标题为Get Genomic Sequence Near Gene的查询页面，在这个页面上，可以获得转录物、编码区、启动子或转录物加启动子的序列。
点击Transcript返回的页面显示完整的转录子，外显子以大写字母表示。
点击Coding Region Only得到的是编码区,外显子以大写字母表示。
点击Transcript + Promoter，返回的页面显示的是在上述选择Transcript所获序列的5′端添加了启动子序列，以大写字母表示外显子。启动子的长度显示在文本框内。
点击Promoter返回的页面正好是启动子区
2 基因启动子序列的预测分析
真核细胞的基因表达调节虽然是多个水平的调节,但主要是转录水平的调节. 转录水平的调节基础就是转录因子蛋白与启动子DNA序列之间的结合和激活. 转录因子蛋白的结构可以分成结合域(BD，binding domain)以及激活域(AD，activation domain). 作为基因启动子DNA的序列也具有特征性的结构. 但是相比较而言，目前基因启动子以及转录因子蛋白结合的种类，积累的资料还十分有限，数据库容量偏小，计算技术相对滞后，其预测结果仅供参考，还必须结合其他的分子生物学技术进行证实.
一般情况下，确定了一种新基因的编码区序列之后，通过与htgs数据库的同源性比对，可以很方便地确定其相应的基因组DNA序列. 在确定编码基因的起始密码子之后，指导基因表达的启动子序列一般位于其上游基因序列300-3 000 nt之间，鲜有例外. 可以从翻译起始密码子上有的基因组DNA序列，选取3 000 nt左右的核苷酸序列进行生物信息学分析. 例如可以应用在线软件分析技术，或自行研发的启动子序列分析技术等软件分析，如：http://www.cbs.dtu.dk/services/promoter/、http://www.fruitfly.org/cgi-bin/seq_tools/promoter.pl，http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/proscan/等. 根据这些软件分析的结果，首先确定进行缺失突变体构建时应该采用的引物序列，如果一段序列的缺失导致报告基因表达水平的升高，那么说明这一段基因序列存在着启动子的静息子(silencer)的序列，对于基因的表达水平具有负调节作用. 通过逐步缺失的策略，最终确定启动子DNA的核心序列. 报告基因表达载体的构建以及细胞转染技术，仍然是目前研究基因启动子序列活性最为基本的方法.
研究转录因子蛋白的结合及其对基因表达水平的调节作用和性质有许多技术,但是利用生物信息学技术预测的启动子DNA序列的结合的转录因子蛋白结果只有部分参考的意义. 凝胶迟滞(gel shift)试验、超级迁移实验(super shift)、竞争性结合实验、酵母单杂交技术(yeast one hybrid)、噬菌体展示技术(phage display)等在转录因子蛋白与启动子DNA序列结合的研究中具有重要应用前景.
干?素γ增?GH3?胞中人生?激素基因表??制 | |
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干?素γ,生?激素基因??子,GH3?胞,?光素酶?告基因interferon-γ,hGH gene promoter,GH3 cell line,luciferase reporter gene | |
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?了研究干?素γ(IFN-r)?大鼠垂?GH3?胞中人生?激素(hGH)基因??子活性的影?及其可能的作用?制，?用?光素酶?告基因方法，?含hGH基因??子(-484~2bp)和?光素酶?告基因的表??粒pGL3-484-Luc???染或?垂?特?性核??因子Pit-1蛋白表??粒(pcDNA-Pit-1-cDNA)或Pit-1反?寡核苷酸(Pit-1 OND)共?染於大鼠垂?GH3?胞中，?察加入IFNγ及?胞?信???途?的抑制?後GH3?胞中?光素酶表?的?化，反映其?hGH??子活性的影?；?含不同?度hGH基因??子序列的?光素酶表??粒pGL3-380-Luc(-380~2bp)、pGL3-250-Luc(-250~2bp)、pGL3-132-Luc(-132~2bp)和pGL3-66-Luc(-66~2bp)分??染GH3?胞，?察它??IFN-γ的反?，以?找IFN-γ影?hGH基因??子活性的??序列。?果表明，IFN-γ(10^5u/L, 10^6u/L)均能促?大鼠垂?GH3?胞中?光素酶的表?，最高??照?的131%(P<0.001)；在胞?信???抑制?中，只有?裂原活化蛋白激酶(MAPK)信???途?抑制?PD98059(40μmol/L)，能完全阻?IFN-γ的促?作用；Pit-1蛋白?表?和表?被抑制?IFNγ的促?作用?有影?；含不同?度hGH基因??子序列?粒中，只有pGL3-380-Luc和pGL3-250-Luc仍具有?IFN-γ的反?性。??明IFN-γ能增?大鼠垂?GH3?胞中hGH基因的??子的活性，此作用可能是通?激活?胞?依?MAPK的途?完成的，??hGH基因上游-250~-132bp??子序列密切相?，但?垂?特?性核??因子Pit-1蛋白??不大。 The method of luciferase reporter gene was used to investigate the effect of interferon-γ (IFN-γ) on the activity of human growth hormone (hGH) gene promoter in rat pituitary GH3 cells, to elucidate the post-receptor signal transduction pathway and the key promoter sequence which mediated the action of IFN-γ. The luciferase expression plasmid pGL3-484-Luc containing hGH gene promoter (-484-2bp) and luciferase reporter gene were transfected alone or cotransfected with pituitary-specific transcription factor Pit-1 expression plasmid (PcDNA-Pit-1-cDNA) or Pit-1 antisense oligonucleotide (Pit-1 OND) into rat GH3 cells. The changes of luciferase expression in the GH3 cells were determined, after treatment with IFN-γ or IFN-γ plus inhibitors of intracellular signaling pathways, to observe the effect of IFN-γ and these inhibitors on the activity of hGH gene promoter. The various deletion constructs of Luc-reporter: pGL3-380-Luc, pGL3-250-Luc, pGL3-132-Luc and pGL3-66-Luc, which contained the -380-2bp, -250-2bp, -132-2bp and -66-2bp sequences of hGH gene promoter, respectively, were transfected into GH3 cells, then the changes of luciferase expression in the GH3 cells were assayed, after treatment with IFN-γ, to find out the key sequence which mediated the action of IFN-γ. Our results showed that IFN-7 (10^5u/L, 10^6u/L) could increase luciferase expression in GH3 cells transfected with pGL3-484-Luc alone, the maximal action being 131% of the control (P<0.001). Among the inhibitors of intracellular signaling transduction pathways, only mitogen-activated protein kinases (MAPK) inhibitor PD98059 (40μmol/L) could completely blocked the stimulatory effect of IFN-γ on hGH gene promoter activity. Pit- overexpression or inhibited Pit-1 expression, both had no effect on IFN-7-induced hGH gene promoter activity. When various deletion constructs of Luc-reporter were transfected into GH3 cells, only pGL3-380-Luc and pGL3-250-Luc still responded to IFN-γ. In conclusion, IFN-γ could increase the activity of hGH gene promoter in rat pituitary GH3 cells. This stimulatory effect of IFN-γ may be associated with the intracellular MAPK signaling pathway and with -252--132bp sequence in hGH gene promoter, but had no relationship with pituitary-specific transcription factor Pit-1. |
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与DNA结合蛋白相作用的启动子序列的鉴定
信息来源：本站原创 更新时间：2004-3-24 14:35:00
将细胞核置于冰上解冻，精确测定核悬浮液的体积。
番茄子叶细胞核的分离提取为例子进行实验
步骤2～7须在4℃下使用高压灭菌过的设备进行。
1．将番茄种子种在灭菌的水饱和滤纸上，置于小盆内，用薄膜封口后，培养7天。用刀片切下番茄子叶后收集备用。
2．将40～50g新鲜组织放入300ml匀浆缓冲液，用韦林氏搅切器先1×4秒而后6×1秒。
3．过滤匀浆混合液，使其透过漏斗上的4层厚纱布及纱布下按孔径递减次序放置的3层Nitex尼龙筛网（300μm，100μm，52μm），汇入大烧杯中。全部匀浆物均滤完后把纱布集中在一起，将纱布上的滤液压入尼龙网，并使其经漏斗流入烧杯中。切勿将滤液压出尼龙网，亦不可使用抽滤，让滤液靠重力作用下流。
4．将每批滤出的匀浆倒入500ml离心瓶中，用Sorvall GS－3转头5000r/min（4225g），4℃离心20分钟。
5．吸去上清，然后将核粗提沉淀物用大口径塑料巴斯德吸管温和地反复吹吸，使沉淀悬浮于匀浆缓冲液中。将重悬起的沉淀转入50ml离心管中，用匀浆缓冲液调节体积至约40ml。
6．4℃用Sorvall SS－34转头4000r/min（1912g）离心10分钟，再次沉淀细胞核。重复步骤5和6三次，分别在3500r/min离心10分钟，8分钟和6分钟。最后一次离心后，尽可能洗净匀浆缓冲液。
7．将核悬浮于核悬浮缓冲液中，按每50g植物组织加0.5ml核悬浮缓冲液。用液氮冷冻，保存于－80℃。若核蛋白抽提即将进行，可不必将核冷冻起来。
核抽提物的制备
2．加入核裂解缓冲液，使NaCl终浓度为0.47 mol/L（即，每毫升核悬浮加入182μl核裂解液）。
3．将核悬浮液置于摇床上，4℃温和摇动30分钟。
4．4℃微量离心20分钟沉淀染色质。
5．小心移出上清，避免搅起胶状的含DNA的沉淀，以使抽提液中避免含有此类杂质。
6．4℃透析上清3～4小时，中间换几次透析液。
7．将透析液用液氮冷冻，再置于冰上解冻，4℃微量离心或用Sorvall SS－34转头10 000r/min（12 000g）离心15分钟，弃沉淀，保留上清。此步骤是为了将其余可能在浓缩步骤中阻塞微量浓缩器的蛋白质沉淀除去。
8．用CENTRICONTM10微量浓缩器浓缩上清，以使提取液中蛋白质的终浓度为1～3mg/ml。可以溶菌酶为标准物用Bio-Rad Bradford-based蛋白质分析试剂盒来测定蛋白质浓度。经验表明，要达到上述浓度，至少需要浓缩2～3次。
9．留出待作迁移分析的核抽提物，将剩余部分用液氮或干冰冷冻，贮于－80℃备用。
DNA片段的标记
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1．安装凝胶装置并洗净玻璃板。
2．配制4％丙稀酰胺凝胶液，将以下成分混合：
丙稀酰胺/双丙稀酰胺（29：1） 4ml
TBE（10×） 3ml
APS（10％） 200
nbsp; 200μl
TEMED40μl
制备厚1mm的凝胶，并保证上样孔可容纳25μl样品。凝胶聚合约需1小时，制好后，使用前可于室温放置1天。
l 探针的标记
1．按下表顺序将下列试剂加入1.5ml微量离心管中：
EcoR I酶解的质粒DNA（1μg或约800fmol末端） 2.5μl
Sequerase®缓冲液（5 2.0μl
[α-32P]dATP（6000 Ci/mmol） 3.0μl
二硫苏糖醇（0.1mol/L）
双蒸去离子水（ddH2O） 0.5μl
Sequerase®酶（用4倍Sequerase®稀释缓冲液稀释） 1.0μl
总体积： 10μl
2．室温放置15分钟。
3．加入0.5μl dNTP混合物，充分混匀。
4．室温放置15
μl 0.35mol/L的乙酸钠并充分吹吸混匀以终止反应。
l 测定掺入的放射性活度
1．取5μl标记反应混合物移至一新管中。将2μl此混合物点加到DE81滤膜上，再将该滤膜浸入盛有约20ml 0.5mol/L磷酸钠（pH7.0）的烧杯中。再取第二张滤膜重复上述操作。
2．将烧杯置于平面振荡器上，使溶液温和振荡5分钟，将缓冲液倒入放射性废弃物中。
3．用新缓冲液重复两次清洗步骤。
4．用双蒸水漂洗滤膜5分钟，再用双蒸水重复漂洗两次。
5．用95％乙醇洗滤膜5分钟。
6．使滤膜完全干燥，再将每一张滤膜移入闪烁计数管，加入闪烁混合物，计数。
7．计算理论掺入的最大比率。计算方法如下：1）每个反应可标记400fmol质粒DNA。2）标记反应在EcoR I酶切的质粒DNA两端进行，每个末端可掺入两个脱氧腺苷磷酸残基。3）因此，每400fmol质粒DNA可结合1600fmol标记核苷酸。4）标记核苷酸的比活性是6000 Ci/mmol，即13 000cpm/fmol。5）因此，理论最大掺入值为每400fmol质粒DNA 13 000cpm×1600fmol＝2.08×107cpm或每400fmol片段1.04×107cpm。注意，仅掺入量的一半包含在待测片段中。随后的酶解反应会释放出一端标记的待测DNA片段和一端标记的载体DNA。
l 标记探针的分离
1．加95μl酚/氯仿/异戊醇（25：24
：1）于剩余的95μl标记混合物中。充分混匀。
2．室温离心3～5分钟以分离酚相与水相。
3．小心取85μl上层水相于另一干净离心管中，将盛有酚相的离心管弃入放射性废弃物中。加入200μl 95％乙醇于水相中，旋紧管盖后，涡旋混匀。
4．将离心管于碎干冰上放置15～20分钟，然后离心20分钟。
5．用移液器，小心将含乙醇的上清弃于放射性废弃物中。加入600μl 80％乙醇洗涤沉淀，离心1～2分钟，用移液器弃去乙醇。
6．用真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀2～3分钟。
7．将沉淀用20μl 1×Sequenase®缓冲液重悬，再加入0.5μl 10units/μl的Pst I将标记的DNA片段从载体DNA上切下。37℃温育30～60分钟。
8．加入2.5μl高EDTA 10×凝胶染液于酶解混合物中。向先制好4％丙稀酰胺凝胶中上样，然后用1×TBE缓冲液在大约10V/cm电压下电泳约2.5小时。电泳时间取决于标记片段的大小。目的是为了很好地分离标记片段与质粒载体，但切勿使目的片段跑出胶外。
9．电泳后，小心地把凝胶用保险膜包裹好，对X光片曝光5～10分钟。使用Sharpie®或其他防水标记物标记胶片及凝胶边缘，以便胶片显像之后可根据标记使凝胶与胶片重合。
10． 切下凝胶上对应地标记DNA的条带，置于1.5ml离心管中。4℃下用300μl洗脱缓冲液温育凝胶薄片过夜，以洗脱DNA
将洗缓冲液移取至另一干净的离心管中。再向凝胶管中加入250μl洗脱缓冲液。－80℃冷冻再解冻，然后将洗脱缓冲液取出与前一次洗脱的溶液合并。将合并后的洗脱液离心10分钟以沉淀聚丙稀酰胺的小碎片。移取上清至另一干净离心管中，用2倍体积的95％乙醇沉淀DNA，碎干冰上放置20分钟，然后离心20分钟。弃上清，用约500μl 80％乙醇洗沉淀。用真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀2～3分钟。
11． 将纯化的DNA片段重悬于20μl片段重悬缓冲液中。取一小等份计数测定回收的片段fmol数。一般情况下，大约可以回收原初标记量的50％。从凝胶中洗脱的效率大约为80％，但是收率会因DNA片段的大小而异。纯化的DNA片段可在4℃最多可以保存2个星期。
迁移率变动分析法
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1．组装电泳装置并洗净玻璃板。
2．按下表配制4％非变性丙稀酰按凝胶溶液：
丙稀酰按/双丙稀酰按（29：1） 4ml
TBE（10×） 3ml
APS（10％） 200μl
TEMED 40μl
可灌制成1～1.5mm厚的凝胶。凝胶聚合约需1小时，使用前可于室温下保存1天。
l DNA－蛋白质结合反应
1．将10mg/ml
的poly(dI-dC)•poly(dI-dC)贮液用无菌双蒸馏水稀释成终浓度6μg/μl。将6μg/μl的poly(dI-dC)•poly(dI-dC)溶液与32mmol/L（pH8.0）的EDTA等体积混合，配制成工作溶液。用片段重悬缓冲液将32P标记的DNA片段稀释至终浓度2fmol/μl。
2．对于标准DNA-蛋白质结合反应，按下表顺序将下列试剂加入1.5ml微量离心管：
32P-标记DNA片段（2fmol/μl） 0.5μl
poly(dI-dC)•poly(dI-dC)＋EDTA工作溶液 0.5μl
核抽提液和/或透析缓冲液 9μl
总体积 10μl
吹吸混匀。
3．室温温育45分钟，此时可将凝胶在100V预电泳10～15分钟。
4．温育结束后，可不加染液直接将样品加在凝胶上。在一个小样孔中单独加入10μl含0.05％二甲苯青和0.05％溴酚蓝的透析缓冲液用来跟踪电泳进程。
5．用1×TBE缓冲液在约10V/cm条件下电泳约2小时。具体时间取决于所使用的DNA片段的大小。
6．小心地把凝胶转移到Whatman 3MM
滤纸上并用保鲜膜覆盖在凝胶上。80℃用凝胶干燥器干燥凝胶约1小时。
7．室温下把干燥凝胶对X光片曝光过夜。
DNase I足迹分析法
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1．组装制作测序胶所需装置并洗净玻璃板。
2．按下表配制4％非变性丙稀酰按凝胶溶液：
丙稀酰按/双丙稀酰按（38：2） 11.3ml
尿素 31.5g
TBE（10×） 3.75ml
APS（10％） 300μl
TEMED 30μl
灌制凝胶。此凝胶聚合约需2小时。使用前可在室温下存放1天。
l DNA－蛋白质结合反应
1．将10mg/ml的poly(dI-dC)•poly(dI-dC)贮液用水稀释成6μg/μl，等体积混合6μg/μl poly(dI-dC)•poly(dI-dC)和32mmol/L EDTA（pH8.0），配制成poly(dI-dC)＋EDTA工作溶液。将32P标记的DNA片段用片段重悬缓冲液稀释成2fmol/μl。
2．对于标准结合反应，将以下试剂按下表顺序逐个加入1.5ml微量离心管：
32P标记DNA片段（2fmol；通常约20 000cpm） 1μl
poly(dI-dC)•poly(dI-dC)＋EDTA工作溶液 1μl
核抽提液和/或透析缓冲液 18μl
（含20～50μg蛋白质，具体用量取决于抽提物中DNA结合蛋白的活性）
总体积 20μl
吹吸混匀。
3．室温温育30分钟。温育过程中，用DNase I稀释缓冲液稀释DNase I。（对于标准结合反应，稀释后的DNase I的浓度为20μg/ml）
4．每管结合反应混合液中加2μl稀释的DNase I 溶液，吹吸混匀（标准结合反应中，DNase I的终浓度为2μg/ml）。室温温育10分钟，从第一次加样入结合反应混合液终起开始计时。
5．加入80μl DNase I终止液和100μl酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）以终止酶解反应。
6．振荡每管样品数秒，注意微量离心管管口应旋紧。室温离心3～5分钟。
7．每管移取85μl上层水相至另一新管，将含酚相的离心管作为放射性废弃物丢弃。向每管水相中加入200
μl 95％乙醇，略作振荡后，将管置于碎干冰上放置15～20分钟。
8．离心20分钟，小心弃上清。向每管沉淀加入500μl 85％乙醇。离心2～3分钟，小心弃去上清，干燥沉淀。
9．将沉淀在真空离心蒸发浓缩器中干燥约5分钟（确保沉淀干燥彻底）。每管中加入3μl甲酰按染液，用Eppendorf振荡器或涡旋混匀。
10． 煮样品3分钟后，立即置于冰上冷却。稍作离心，使样品汇集于管底，再放回冰上。上样于6％测序胶，然后用1×测序TBE缓冲液，在45～50℃ 3000~4000V下电泳，直至溴酚蓝走到凝胶底部。电泳过程中，为保持凝胶温度在45～50℃，可能需要加大电压。
11． 甲醇/乙酸/H2O（5：5：90）固定凝胶15分钟后，将胶移至Whatman 3MM滤纸上用凝胶干燥器干燥。
12． 把干燥凝胶对X光片在－80℃曝光过夜，需使用增感屏。
