Real－Time PCR (RT-PCR)之三

1. SolD 离心柱法提取RNA

刘小丰2007.01.16.

自备与准备液体：

1.氯仿/异戊醇（24：1）

2.无水乙醇。南京妇幼保健院乳腺科刘小丰

3. RFE Solution在首次使用之前，加入4倍体积的无水乙醇。

4.Sol D:

异硫氰酸胍 50g

100 mM 枸橼酸钠 25ml（即柠檬酸三钠 MW294.10，25ml用0.735g）

65°下溶解

10％十二烷基肌氨酸钠（MW 293.39）50ml（取5g十二烷基肌氨酸钠）

灭菌MQ 水  add  100ml。

室温保存3月。

（每50mlSol D 加0.36ml β－巯基乙醇后，仅可以放置2月。）

SolD离心柱法提取RNA的原理：

GenClean柱中的膜能选择性的与RNA结合，不结合蛋白等杂质。结合在膜上的DNA和其它杂质用RFE Solution等液体洗去。结合在膜上的RNA用DEPC水洗脱，即为RNA产品。

Trizol 0.5ml可以最多消化裂解1X10⁷细胞或50mg组织。

 

1. 25平方厘米培养瓶中加入SolD0.35ml或Trizol 0.5ml。Trizol用摇床摇半小时以上。SolD用手摇使之流动到整个瓶底。SolD作用这可以在数分钟后用细胞刮子将细胞及裂解液刮掉。作用半小时后，用SolD或Trizol都可以用吸嘴将裂解液吸入一只1.5ml的Eppendorf管中。

2. 用1ml的吸嘴和枪反复吹打15-20次。

3. 加入100ul氯仿/异戊醇（24：1），剧烈振荡混匀30秒。

4. 12000rpm，室温离心5分钟。

5. 将上清液（约450ul）小心转移到灭菌的1.5ml的Eppendorf管中。加入150ul无水乙醇，手动混匀。

6. 将上述溶液全部转移到套放在2ml收集管中的GenClean柱中，室温放置2分钟。8000rpm离心1分钟。开DU800测RNA浓度用。

7.小心取出柱子，弃去收集管中的废液。将柱子放回收集管中。向柱子中加入450ul RFE Solution，10000rpm，室温离心30秒。

8. 重复步骤7一次。

9. 小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回离心管中。10000rpm，室温离心30秒。

10.小心取出柱子，放入另一只灭菌的1.5ml的Eppendorf管中，在柱内膜的中央小心加入40ul的DEPC水，55-80°C放置2分钟，（室温放置RNA的产率低约20％）。准备1.5ml的离心管放入99ul的DEPC水，备测RNA浓度用。

11.8000rpm，室温离心1分钟，将离心后的含有RNA的离心管中的液体，再次放入柱内膜中，室温放置2分钟，以增加RNA的产率。离心管中的液体即为RNA样品。