Real－Time PCR (RT-PCR) 之六：

Real－Time PCR for DARC

 

实验者：刘小丰

试验日期：200  .   .   .

DARC为目的基因，GAPDH为待测基因。

一 、Real－Time PCR的加样（15ul反应体系）：南京妇幼保健院乳腺科刘小丰

cDNA2.0ul，分别来自以下细胞系:

 

 

 

 

 

15ul体系：8孔管*2排。6个样品加上1个阴性、1个阳性对照。

l       先从冰箱中取出2对引物，以便融化。

l       取冰盒装冰，

l       将cDNA模板放在冰上的操作板孔中。

Step 1: 取2只1.5ml或2.0ml的EP管，分别标明D,G.指代DARC和GAPDH。

依次加入以下试剂；

          2×Master Mix   7.5ul×16管＝120ul

         （可以不加） 50×Rox reference Dye 0.02ul×___管＝___ul

ddH₂O  5.4ul×16管＝86.4ul     总共＝206.4ul

必须充分混匀。

再将以上总共容量的一半103.2ul 加入其中一只1.5ml或2.0ml的EP管。

Step 2:      在一只标D的EP管中加入DARC Primer （up）：0.3ul×8管＝2.4ul

                       DARC Primer （down）：0.3ul×8管＝2.4ul

       另一只EP管中加入GAPCDH  Primer （up）：0.3ul×8管＝2.4ul

                         GAPDH  Primer （down）：0.3ul×8管＝2.4ul

每只EP管中有108ul。离心、振荡、再离心

Step 3: 取8孔排管，标记。每孔加入上述一管中的混合物13.5ul。

Step 4: 每一个8孔排管的前2孔各加入检测细胞系未加处理因素的231细胞两个样品的cDNA1.5ul，，一定要最少2个以减少误差。

每一个8孔排管的第3、4、5、6孔各加入检测的处理因素作用的细胞系cDNA1.5ul。

每一个8孔排管的第7孔各加入脾脏的cDNA1.5ul，作为阳性对照。

每一个8孔排管的第8孔各加入dd H₂O 1.5ul，作为空白对照。

下图以231细胞il－1作用6小时为例，231细胞il－1作用0.5、1、2、4小时记作2i0.5h、2i1h、2i2h、2i4h。

231 DARC    231 DARC’    2i0.5h DARC   2i1h DARC          2i2h DARC    2i4h GAPDH   spleen DARC  blank DARC

231 GAPDH     231 GAPDH    2i0.5h GAPDH’  2i1h GAPDH    2i2h GAPDH   2i4h DARC    spleen GAPDH  blank GAPDH 

Step 5: 离心、振荡混匀、再离心。

 

二、上机及运行：

开机、开电脑。

纵向排列各管，记住各管位置。231细胞il－1作用0.5小时记作2i0.5，余类推。

调用前各孔排列标记情况。加以修改。

调用前protocal，run。

结束程序，先点“stop”，再关闭右上角“×”后，出现对话框，一定要选“YES”，才能保存数据。

 

三、数据统计及统计图表：

Step 1：求ΔCT(目的基因) 均值：

求CT(目的基因) 均值： CT(2i6 DARC) 均值= 1/2 (CT(2i6 DARC) +CT(2i6 DARC’))    

求CT(管家基因) 均值： CT(2i6 GAPDH) 均值= 1/2 (CT(2i6 GAPDH) +CT(2i6 GAPDH’))  

求ΔCT(目的基因) 均值： ΔCT(2i6 DARC) 均值＝CT(目的基因) 均值 － CT(管家基因) 均值

＝CT(2i6 DARC) 均值－CT(2i6 GAPDH) 均值 

同样求（231原始细胞的DARC）231 DARC表达情况，即ΔCT(231 DARC) 均值。

ΔCT(231 DARC) 均值= CT(231 DARC) 均值－CT(231 GAPDH) 均值 

 

Step 2：比较2i6 细胞DARC表达与231细胞DARC表达的比例关系。

ΔΔ CT(2i6 DARC)＝ΔCT(2i6 DARC) 均值－ΔCT(231 DARC) 均值

ΔΔ CT(231 DARC)＝ΔCT(231 DARC) 均值－ΔCT(231 DARC) 均值＝0

2i6 细胞DARC表达与231细胞DARC表达的比例关系为：

2^{－ΔΔ CT(2i6 DARC)} /2^{－ΔΔ CT(231 DARC)} = 2^{－ΔΔ CT(2i6 DARC)}

Step 3：试验结果：

      ________作用231，435细胞后，其DARC表达与231/435细胞DARC表达的比例关系为：

 

 

 

 

 

 

 

柱形图表示为：