姜黄素对肺腺癌A549细胞凋亡的影响及其机制

[摘要]  目的 观察姜黄素对肺腺癌细胞a549生长的抑制，并探索其机制。方法四氮唑蓝法测定姜黄素作用于肺腺癌细胞a549的吸光值，计算细胞抑制率；流式细胞仪测定40μmol?l^-1姜黄素或空白对照培养液的肺腺癌细胞凋亡率与凋亡相关蛋白caspase9表达；比色法测定凋亡相关蛋白caspase-3，caspase-8表达；观察加用caspase-9抑制剂后caspase-3的表达。结果 姜黄素对肺腺癌a549细胞有抑制作用，存在剂量依赖（r＝0.619 ；p<0.01）与时间依赖（r＝0.618； p<0.01）；姜黄素对肺腺癌a549的凋亡率(30.25%)明显高于对照组（1.32%）（p<0.001）；姜黄素组肺腺癌细胞a549的凋亡相关因子caspase-3、caspase-8、caspase-9表达明显高于对照组（p<0.001）；姜-黄素组加用caspase-9抑制剂后caspase-3表达明显下降，仍高于对照组（p<0.001）；结论 姜黄素诱导肺腺癌a549细胞凋亡可能与激活caspase-8 、caspase-9、caspase-3有关。上海东方医院呼吸内科梁永杰

[关键词] 姜黄素；肺腺癌a549细胞；细胞凋亡；caspase家族；流式细胞术

[中图分类号]　ｒ969.4　　[文献标识码]ａ　[文章编号]1007-4406（2005）

 

the effects and mechanisms of curcumin on apoptosis of lung adenocarcinoma a549 cells

tian dezeng，zhu hui，liang yongjie  ( department of respiratory，dongfang hospital，tongji university，shanghai  200120，china)

[abstract] aim:to explore the effect of curcumin on inhibiting the apoptosis of the lung adenocarcinoma a549 cells and related mechanism. methods:1)the inhibiting ratio of curcumin in different concentrations  were determined by mtt assay at different times;the apoptosis rates of  a549 cells cultured with 40μmol?l^-1 curcumin were calculated by flowcytometry.2)the caspase-9 expression of each group was determined by flowcytometry. the caspase-8 and caspase-3 expression of each group were determined by colorimetry set.the caspase-3 expressions of curcumin groups added caspase-9 inhibitor were determined in the same way.3) statistics method: χ² test or t test with spss10.0 software.results: 1)the inhibition of curcumin on were shown in the dose?dependent and time-dependent manner(p<0.01).2)the apoptosis rate of a549 cells induced by curcumin (30.25%)was remarkably higher than the control（1.32%）(p<0.001).3)the expressions of caspase-3、-8、-9 induced by curcumin were obvious compared with the control (p<0.001).after using caspase-9 inhibitor , the expression of caspase-3 decrease remarkably（p<0.001）,but it was more than control group（p<0.001）. conclusions: curcumin can activate the expression of caspase-8,caspase-9 and caspase-3 and induce the apoptosis of lung adenocarcinoma a549 cells through mitochondrion-depended and  mitochondrion-undepended pathway.

[key words]: curcumin; lung adenocarcinoma a549 cell apoptosis; caspase family ; flowcytometry

姜黄素 (curcumin) 是一种植物多酚，来源于姜黄、郁金、莪术、菖蒲等中药的根茎，化学结构为ｃ₂₁ｈ₂₀ｏ₆，分子量368.39。姜黄素可以抑制多种肿瘤细胞系的生长，预防化学性和放射性诱导的啮齿类动物肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、大肠癌、胰腺癌和乳腺癌等多种癌瘤的形成^[1]。但有关肺癌的研究少见。

1 材料与方法

1.   1材料 肺腺癌细胞株ａ549(中科院上海细胞)； annexin-?-fitc凋亡检测试剂盒和apoalert caspase系列比色法试剂盒(bd biosciences pharmingen)；caspase-9抑制剂z- vad-fmk和caspase-9测定试剂盒(merch公司)；姜黄素(sigma公司)；小牛血清、mtt、胰蛋白酶、rpmi-1640（华美公司）； nahco₃、edta-四钠盐、hcl、nacl 、kcl 、dmso 等为国产分析纯；5%co₂培养箱；酶标分光仪；倒置荧光显微镜；酸度计；流式细胞仪；超净工作台；-70℃ 超低温冰箱；高速低温离心机。

rpmi-1640细胞培养液（200m l）配制方法：rpmi-1640干粉2.08g＋0.349g nahco₃＋青霉素20000u＋链霉素20000u＋三蒸水180m l，用5％nahco₃与1mol?l^-1hcl调整ph值为7.2，然后加入56℃^。灭活30min的小牛血清20ml，过滤除菌4℃保存。

姜黄素配制方法：①姜黄素储存液：姜黄素113.4mg＋10ml rpmi-1640细胞培养液-20℃保存；②姜黄素母液： 50μl储存液＋9.5ml rpmi-1640细胞培养液调整ph值至7.2过滤除菌4℃保存，需要时用rpmi-1640细胞培养液稀释至所需浓度。

1.2细胞培养 消化、收集对数生长期的细胞，按每瓶4×10⁶个细胞接种3瓶5×5cm²培养瓶，置37℃、5%co₂培养箱中培养24h，吸出培养液，其中2瓶为处理组与对照组，前者加入40μmol?l^-1姜黄素5ml；后者加等量的rpmi-1640细胞培养液，继续培养24h。用0.05％胰蛋白酶消化并收集细胞。计数，分4份，每份1×10⁶个细胞，2份立即分别测凋亡、caspase-9，2份­70℃冻存，以备测定caspase-3、caspase-8。第3瓶在加入的40μmol?l^-1姜黄素5ml的基础上加用caspase-9抑制剂z- vad-fmk5μl培养24h后测定caspase-3。以上实验相同条件下重复3次。

1.3细胞生长抑制率测定 消化、搜集对数生长期的肺腺癌ａ549细胞，将细胞密度调整至2×10⁴/100μl，吸取100μl细胞接种于96孔板，37℃、5%co₂培养箱孵育24h以让细胞贴壁，吸出培养液，分别加入100μl 4种不同终浓度的姜黄素（0、5、10、20、40μmol?l^-1），每1浓度6孔；分别培养达需要时间6h、12h、24h、48h后加入20μl 5.0g?l^-1的mtt溶液继续培养4小时, 吸净培养液后每孔加100μldmso，振荡 10min，在酶标仪上测 492nm吸光值（od），计算各组细胞生长抑制率 =(1?实验组od /对照组od )×1 0 0 %。

1.4细胞凋亡率测定：按annexin-?-fitc凋亡检测试剂盒说明测定，具体步骤如下：①）将1.2搜集的细胞用冷pbs洗涤细胞两次，然后用结合缓冲液重新悬浮细胞，浓度为1×10⁶细胞?ml^-1；②移液器吸取100μl溶液置5ml培养管；③加入5μl的annexin-?-fitc和5μl的pi；④轻轻地摇匀细胞，室温下避光孵育15min；⑤每管加入400μl结合缓冲液，1h内用流式细胞仪测定凋亡率。

1.5 caspase-3、caspase-8测定 应用bd公司apoalert caspase系列比色法试剂盒测定，具体步骤如下：①将1.2冻存的细胞解冻3,000 r?min^-1离心5min去上清液；②用冷细胞裂解缓冲液50μl重悬细胞，置冰上孵育10min。③4℃离心机14,000r?min^-1离心10min，沉淀细胞碎片，将上清液转移至新的离心管，置冰上；④每份加入50μl2×反应缓冲液/dtt混合液；⑤每份加入5μl 1mmol?l^-1的caspase-3底物或caspase-8底物，37℃水浴箱孵育1h；⑥用微板读取器在405nm读取吸光值，根据标准曲线计算浓度；⑦标准曲线绘制：用dmso溶解稀释pna，分别制成0、0.5、1.0、2.0和4.0 mmol?l^-1的储藏液；各组取5μl储藏液，分别加入95μl的细胞裂解缓冲液，制成终浓度为0、25、50、100、200μmol?l^-1的pna；用微板读取器在405nm读取吸光值；以pna为横坐标、吸光值为纵坐标绘制曲线。

1.6 caspase-9测定 按试剂盒说明进行，具体操作如下：①1.2搜集的细胞，调整细胞数为1×10⁶?ml^-1；②各组取300μl置离心管，分别加入1μlfitc-lehd-fmk，在37℃5%co2培养箱中孵化45min；③3000 r?min^-1离心5min，去上清；④0.5ml洗涤缓冲液重悬细胞，再离心，去上清；⑤重复④；⑥300μl洗涤缓冲液重悬细胞，置于冰上。⑦用流式细胞仪通过fl-1道分析样本，记录结果，存盘。

1.7统计学处理 用spss10.0软件行χ²检验、t检验。

 

2结果

2.1对肺腺癌a549细胞的抑制情况 姜黄素对肺腺癌a549细胞的抑制率与浓度和时间均呈正相关，pearson相关分析前者r＝0.619，p<0.01；后者r＝0.618，p<0.01。 40μmol?l^-1作用48h抑制率达30.15%(表1)。

2.2姜黄素诱导肺腺癌a549细胞凋亡情况 40μmol?l^-1姜黄素作用24h，肺腺癌a549细胞凋亡率达30.25%，明显高于空白对照组（1.32%）， r*c列表卡方检验p<0.01(表2)。

2.3 姜黄素caspase-8、caspase-9、caspase-3表达的影响 40μmol?l^-1姜黄素作用24h，肺腺癌a549细胞caspase-8、caspase-3表达明显高于对照组，配对样本t检验，p?0.01(表3)； caspase-9表达阳性率达30.20%，亦明显高于对照组2.70%（p<0.01）。

2.4加用caspase-9抑制剂后caspase-3的变化：姜黄素组加用caspase-9抑制剂后作用24h，caspase-3表达由23.61±0..398μmol?l^-1明显下降到14.18±2.112μmol?l^-1，但仍高于对照组（3.69±0.486μmol?l^-1），配对t检验显示有显著差异，p<0.01(表4)。

3 讨论

近来实验研究表明姜黄素抗肿瘤作用具有多位点、广谱性，与化疗药物联合有协同作用：姜黄素可通过p53依赖性途径, 提高p53的表达, 增强p53dna的结合活性, 继而增强p53下游效应器bax的表达, 从而诱导乳腺癌细mcf27细胞凋亡^[2]；姜黄素可明显抑制化疗药阿霉素、5-氟尿嘧啶、顺铂和紫杉醇诱导的nf-κb 的激活,增强癌细胞对化疗药的敏感性^[3]；姜黄素能抑制k562 细胞stat5 信号分子的活化及表达,进一步抑制白血病细胞的增殖^[4]; 姜黄素能够抑制在肿瘤组织中呈高表达的抑制凋亡蛋白-survivin的表达，诱导膀胱肿瘤细胞株t24和biu87凋亡，呈现剂量、时间依赖^[5]。本实验亦证实姜黄素可激活caspase-8、caspase-9、caspase-3，诱导肺腺癌a549细胞凋亡。

细胞凋亡有2条不同的通路：一条是线粒体非依赖的，细胞内外的凋亡信号活化启始的caspase-8，进一步引起caspase的级联反应，最终激活下游的caspase-3使细胞凋亡；第2条途径是依赖线粒体的，活化的caspase-8作用于bcl-2家族成员bid，使其催化断裂，其端部分活化并转位至线粒体膜，使其通透性发生改变，释放出细胞色素c，细胞色素c与结合分子apaf-1结合后，再与procaspase-9结合，形成凋亡复合体，活化caspase-9及下游的caspase-3，从而引发凋亡。本实验显示姜黄素能增加a549细胞caspase-8、caspase-9、caspase-3的表达，加用caspase-9抑制剂后，caspase-3的表达明显下降，但仍高于对照组，提示姜黄素通过上述两条途径诱导肺腺癌a549细胞凋亡。

[参考文献]

[1]  麦镇江.姜黄素的药理作用研究进展[j].中药材,2004,27( 9):698.

[2]  choudhuri tp, agwarwal ml. curumin induces apoptosis in human breast cancer cells through p53-dependent bax induction [j].febs lett, 2002, 512 (1-3):334.

[3]  chuang se, yeh py, ku ys, et al. basal levels and patterns of anticancer drug-induced activation of nuclear factor-κb ( nf-κb) and its attenuation by tamoxifen,dexamethasone, and curcumin in carcinoma cells [j].biochem pharmacol,2002,63(9):1709.

[4]  陈伟红,陈燕,谷俊侠等.姜黄素对k562细胞stat5信号分子的影响[j]. 中华血液学杂志,200 4,25 (3):151.

[5]  邱学德,杨宇如,宋建新,等.姜黄素对膀胱肿瘤细胞株t24 和biu87 增殖影响[j].华西医学2004,119(12):274.

表1:不同浓度姜黄素、作用不同时间对肺腺癌a549细胞的抑制率（ ± s%, n=6）

table1:inhibiting ratio of lung adenocarcinoma a549 cell in different concentrations curcumin  at different times（ ± s%, n=6）

time （hour）	curcumin concentration（μmol?l-1）
	5	10	20	40
6	3.19±0.106	6.38±1.170	11.70±0.426	15.96±0.436
12	5.10±0.306	14.29±0.204	19.00±0.306	19.39±0.520
24	7.96±3.894	20.35±0.354	22.12±0.177	24.78±0.267
48	11.76±3.162	24.26±0.147	27.21±0.074	30.15±0.360

note:pearson correlation between inhibiting ratio and curcumin concentration was 0.619,р＜0.01.pearson correlation between inhibiting ratio and curcumin time was 0.618 ,р＜0.01.

 

表2: 40μmol?l^-1姜黄素对肺腺癌a549细胞凋亡率影响 (р＜0.01）

table2:lung adenocarcinoma a549 cell apoptosis ratio in  40μmol?l^-1 curcumin(р＜0.01)

	negtive clls	positive cells	apoptosis ratio
curcumin group	2626	1139	30.25
control group	9977	133	1.32

 

 

表3: 姜黄素对肺腺癌a549细胞caspase-8、caspase-3表达的作用（ ± sμmol?l^-1, n=3, р＜0.01）

table3: effect of expression of lung adenocarcinoma a549 cell caspase-8、caspase-3 in  curcumin（ ± sμmol?l^-1, n=3, р＜0.01）

	curcumin group	control group
caspase-8	26.84±1.511	2.87±0.633
caspase-3	23.61±0.398	3.69±0.486

 

 

 

表4:加用 caspase-9抑制剂后caspase-3表达的变化（ ± sμmol?l^-1, n=3）

table4: change of caspase-3 expression in caspase-9 inhibitor（ ± sμmol?l^-1, n=3）

	no-using caspase-9 inhibitor	using caspase-9 inhibito
curcumin group	23.61±0..398	14.18±2.112a,b
control group	3.71±0.356	3.69±0.468

note:a means р＜0.01 comparing with no-using caspase-9 inhibitor;b a means р＜0.01 comparing with control group.