注射光敏剂与激光照射间隔时间的PDT实验研究

李黎波¹ 罗荣城¹ 周传农²

 

摘要

目的 探索恶性肿瘤光动力治疗注射光敏剂后的最佳光照时间。南方医科大学南方医院肿瘤科李黎波

方法 制作昆明小鼠S180肿瘤实验动物模型，对照组为单纯肿瘤组，不给以光敏剂和激光照射。实验组给以光敏剂Photofrin并630nm激光照射，根据注射光敏剂后激光照射时间的不同分9组，每组合格荷瘤小鼠15只。在光照后即刻、光照后48h各处死1只小鼠获取肿瘤标本，其余每组保证有12只小鼠作长期疗效观察。光照后每天观察肿瘤及皮肤变化情况并计算小鼠生存率。光照后40天处死所有小鼠获取肿瘤标本进行组织学检查和电子显微镜检查。

结果 光照后小鼠皮肤反应以T1～T5组为重；T6～T9组光照后患侧肢体瘫痪的发生率较低；光照后40dT6-T9组部分小鼠修复皮肤易形成瘢痕；用光敏剂后1～12h肿瘤复发率低；从皮肤组织学修复方面看PDT的光照时间应当在应用光敏剂后6h以内为好；电镜观察细胞结构显示T5T6T7光照后即刻线粒体肿胀最为明显。

讨论 PDT的最佳光照时间应当选择在注射光敏剂后6-12h左右为好。

 

关键词：激光；光动力疗法；光敏剂；光照时间；恶性肿瘤

 

 

Study on Laser Irradiation Time in Malignant Tumor Photodynamic Therapy after Photofrin Infusion

 

LI Li-bo，LUO Rong-cheng, ZHOU Chuan-nong

Department of Oncology, Nanfang Hospital, Southern Medical University. Guangzhou, 510515.

 

ABSTRACT

Objective To explore the best time to irradiate the tumor after the photofrin’s injection to get the best PDT efficancy.

Methods The control group was not given photofrin and laser irradiation. The experiment groups were given photofrin and laser irradiation. According to the different irradiation interval time after photofrin’s injection, the groups were devided as 9 groups. We got the specimens from the killed mouse at once and 48h after irradiation in every experiment group. It was assured that 12 mice in every group were observed for long survive study. All of the mice were killed to get the specimens on the 40 days after irradiation. With the photofrin as 7.5mg/kg was injected into the mouse body. The planted tumor of the mouse was radiated with microlens fiber at energy fluence of 120J/cm2. The tumor specimens was also took to do routine pathology examination and electron microscope examination.

Results Skin reaction was gently from the appearance of the skin after irradiation and the paralysis incidence was lower in T6-T9. But some of the cured T6-T9 mice had skin scar formation. The best time to reduce tumor relapse was irradiated at 1-12h after photosensitizer’s injection. Under electron microscope, the cytochondriomes tumescence was severe in T5T6T7. And there was no difference between the experiment groups in tumor cells necrosis under electron microscope and microscope.

Conclusions we considered the best irradiating time was at 12h after photofrin’s injection.

 

Key words: Lasers; Photodynamic therapy; Photosensitizer; Irradiation time; Malignant tumor

 

光动力疗法（Photodynamic Therapy，PDT）是一种治疗恶性肿瘤的新技术。Dougherty^［1］等早在二十世纪七十年代就将这一疗法用于恶性肿瘤的治疗，并收到明显的效果。随着光敏剂、激光照射手段的逐渐完善，特别是由于激光具有相干性和方向性好、能量密度大及可经光纤传输等特点，使PDT的应用范围进一步扩大,临床应用越来越广泛。本研究针对光敏剂注入体内后至激光照射治疗期间的间隔时间进行动物实验研究，力图寻找出最佳同时又是PDT最有效的光照时间，为临床恶性肿瘤患者提供更好的治疗。

材料和方法

一、实验材料

1．实验动物 昆明种雄性小鼠165只，4周龄，体重20g左右。分笼饲养。

2．瘤细胞 小鼠纤维肉瘤细胞S180由中山大学实验动物中心提供。

3．光敏剂：Photofrin注射剂，由加拿大药业有限公司生产。

4．激光发生仪（光源） Diomed 630型半导体激光治疗机，由英国激光仪器有限公司生产，波长630nm，脉冲输出，最高输出功率为2W。

5．光导纤维 微透镜光导纤维由英国激光仪器有限公司生产，最高输出功率为400mW，以保证输出功率均匀一致以及光导纤维的安全使用。

6. 透射电镜 JEM-1200EX透射电镜（德国生产）。

二、实验方法

1. 小鼠移植性肿瘤S180模型的建立 选择腹腔接种S180细胞第7天传代KM小鼠，无菌条件下用7号针头抽取腹水（清亮淡白色）1ml，置于10ml离心管内，用生理盐水稀释10倍，吸管充分吹打均匀，1000r/min离心5min，弃上清。反复冲洗2～3次后用200目细胞筛过滤，最后按一定比例加入生理盐水、青霉素（100Ｕ/L）和链霉素（100Ｕ/L）配成比例约1.0×10⁷/ml腹水稀释液，吸取0.2ml腹水稀释液，于小鼠臀部脱毛处中央皮下接种。每只小鼠只接种1个肿瘤，待肿瘤生长到7～9mm直径时进行实验（5～7天），选择皮下生长良好、无溃疡、呈半球状单一肿瘤的实验鼠为合格荷瘤模型小鼠。实验用合格模型鼠共计155只。

2. 分组 （1）PDT组：注射光敏剂Photofrin后进行630nm激光照射。根据注射光敏剂和激光照射之间的时间间隔不同分组，分别为注射光敏剂Photofrin后1min（T1）、5 min（T2）、 15 min（T3）、 30 min（T4）、 60 min（T5）、6h（T6）、 12h（T7）、 24h（T8）、 48h（T9）给以激光照射9组。各组均于照光后即可和48h各处死1只小鼠，剥取肿瘤。每组另有12只小鼠供长期疗效观察。于照光后40天处死剥取肿瘤组织备用；光照后40天处死所有小鼠获取肿瘤标本。（2）对照组为单纯荷瘤组，不给光敏剂和激光治疗。

3．注射光敏剂 将Photofrin用5%葡萄糖稀释，其浓度为1mg/ml，按7.5mg/kg尾静脉注射。以上操作均在暗室中进行。

4．激光照射 将小鼠用橡皮筋固定于光照治疗板上，用光导纤维固定架固定光导纤维。光纤输出功率为360mW，照射时间为500s，光斑覆盖肿瘤，光斑直径约1.4cm，激光功率密度为240mW/cm²，能量密度为120J/cm²。每只小鼠只需激光照射治疗1次。

5．肿瘤大体形态观察 光照后每天观察肿瘤变化情况，以治疗后肿瘤完全消失，并在40天内不复发作为治愈标准，计算小鼠活存率。荷瘤小鼠在处死后，剥开皮肤，暴露肿瘤，观察肿瘤外观形态、色泽、质地、切面、大小等。

6．肿瘤组织的病理切片观察 小鼠处死后，各例肿瘤均取材若干块，用0.01M PBS(pH=7.4)配制的10%福尔马林固定液固定，经常规石蜡包埋，切片，HE染色后在显微镜下观察其病理变化。

7．透射电镜观察 每组取1mm³肿瘤数块，经常规固定、脱水、浸透、固化、切片，枸橼酸铅染色后，用电镜观察并摄片。

结      果

一、PDT后局部皮肤修复过程

小鼠肿瘤在激光照射5~8h后，皮肤出现局部充血、红斑样变。而后逐渐出现水肿、水泡，创面有渗液外溢现象，并有组织坏死、溃疡形成。在此阶段，T1~T5组小鼠表现光照部位皮肤创伤明显，皮肤损伤范围大，溃疡面形成也较大，第8d左右瘤体萎缩，9~10d后溃疡面形成棕色痂皮，约21d左右溃疡基底新生上皮逐渐形成，痂皮脱落，新生上皮，25d左右再生皮肤新生毛发（见图1）。

图1 皮肤PDT治疗后愈合过程：A 光照后即刻；B 光照后24h；C 光照后48h；D 光照后10d；E 光照后15d；F光照后25d

Fig. 1 Skin healing processs after PDT： A  immediately after laser irradiation; B 24h after laser irradiation; C 48h after laser irradiation; D 10d after laser irradiation; E 15d after laser irradiation; F 25d after laser irradiation.

 

二、小鼠活存率

在实验组中T1组到T7组小鼠在光照后24h到48h的近期死亡率依次降低，T2组的死亡率高达41.7%，而T7组也有近8.3%。小鼠肿瘤复发以光照后最短时间(T1T2组)和最长时间(T8T9组)为多见。荷瘤小鼠生存情况见表1，对照组至第33天荷瘤小鼠全部死亡，而实验组40天后的存活率仍然高达50％以上，其中存活率仍以T6T7T8为最好。

 

表1 实验组荷瘤小鼠生存情况

Table 1  Death occurred in different experimental groups

 

分组	n	近期死亡(%)	复发死亡(%)	长期存活(%)
T1	12	4(33.3)	2(16.7)	6(50.0)
T2	12	5(41.7)	1(8.3)	6(50.0)
T3	12	4(33.3)	0	8(66.7)
T4	12	4(33.3)	1(8.3)	7(58.3)
T5	12	3(25.0)	0	9(75.0)
T6	12	2(16.7)	0	10(83.3)
T7	12	1(8.3)	0	11(91.7)
T8	12	0	1(8.3)	11(91.7)
T9	12	1(8.3)	2(16.7)	9(75.0)
合计	108	24(22.2)	7(6.5)	77(71.3)

 

三．组织学变化

1．对照组 植瘤组织中央部位有轻度坏死，边缘部位瘤细胞增殖旺盛，细胞形态多样，异型性大，核分裂相多。中央部位瘤细胞一般散在，坏死肿瘤细胞较多，瘤组织外部有薄层包囊。第30天小鼠肿瘤中央液化坏死，主要以包囊形式存在，包囊层肿瘤细胞生长旺盛，近肿瘤中央处可见清晰的三种条带：肿瘤细胞生长活跃区、肿瘤细胞部分坏死区和肿瘤坏死区。

2．PDT各组

（1）PDT后共同特点 即刻处死组可见直接光照的癌组织内，癌巢的退行性的分布较为均匀，中央部分明显，表面、边缘部位残存的癌细胞明显多于中央部位，且肿瘤细胞死亡不明显。光照后 48h，肿瘤组织大片死亡，许多瘤细胞仅余破碎严重的残余轮廓，坏死则以凝固性坏死为主，微血管内皮细胞也多见严重损伤，血管内皮细胞脱落，T1~T5组多见血管内血栓形成，偶尔见有个别结构损伤较轻的毛细血管存在。

（2） 皮肤及皮下组织改变 光照后48h T1~T9组处死小鼠皮肤及皮下组织病理切片显微镜下观察结果见图2。一般可见，皮肤表皮层坏死，皮下组织不同程度的水肿，绝大多数毛囊细胞坏死， T1~T5尚有少数毛囊细胞存活，而T6~T9则几乎看不到正常存活的毛囊细胞。除此之外，T2可见皮肤组织大部分坏死，但表皮层有部分存活。T3可见光照皮肤与未光照皮肤的交界处，左侧皮肤组织坏死明显，而右侧皮肤组织表皮层和毛囊损伤不明显。T7皮肤坏死比较严重，表皮层可见水泡形成。T7~T9组皮肤表层和毛囊坏死很严重。

图 2 光照后48h处死组皮肤组织  ×200

Fig. 2  Skin damages in T1-T9 mice killed 48h after laser irradiation.  ×200

 

四、电镜观察 (见图3)

1．对照组 肿瘤细胞轮廓清晰，胞膜完整，细胞形状不一，呈圆形、椭圆形或不规则形；细胞核膜清晰，染色质着色均匀，核仁多为单个，偶见双核仁；细胞质中可见丰富的线粒体、发达的内质网和游离的核糖体。细胞核形不一，多呈不规则形、肾形或半月形。肿瘤组织中央常见坏死的瘤细胞，细胞结构模糊不清，有的细胞已经崩解、破碎。

2．PDT后即刻处死组 T1~T9各组瘤细胞的破坏程度其共同特点是绝大部分细胞只是出现程度不等的线粒体肿胀，其中以T3、T4和T5组中线粒体肿胀最为明显。有的细胞出现脂滴，细胞间隙变得狭窄甚至消失。其它方面则与对照组小鼠相似。

3．PDT后48h处死组 PDT组均见到大片的坏死区域，大量死亡的瘤细胞已经崩解、破碎，细胞结构消失或模糊不清，有的细胞尚可见核膜破裂或消失，核质外流。

图3 a.对照组瘤细胞      b.T1组×4000 c.T3组×4000 d.T5组×4000 e.T7组×6000 f.T9组×5000光照后即刻处死小鼠的瘤细胞电镜照片

Fig. 3  a. Electron microscopic appearance of a tumor cell in a control mouse. ×5000  electron microscopic appearance of tumor cells of mouse killed immediately after laser irradiation a tumor cell in b. T1 group×4000  c. T3 group ×4000  d. T5 group ×6000  e. T7 group×6000 f. T9 group mouse killed immediately after laser irradiation ×6000

 

讨      论

从实验结果可见，PDT各组在光照后即刻处死小鼠的肿瘤外观形态基本相似，只是从T1到T9组，随着注射光敏剂和激光照射时间间隔的延长，光照部位的充血肿胀程度逐渐减轻；光照后48h处死的各PDT组的外观形态与光照后即刻处死组不同之处在于，光照部位皮肤色泽明显变深，皮肤失去弹性，变硬，与正常皮肤边界清楚，隆起肿瘤处已趋于平坦^［2］，切开皮肤可见更多渗出，其可能原因是注射光敏剂后短时间内，血浆内光敏剂浓度很高，而扩散到血管外基质和组织中的光敏剂尚很少。血浆内光敏剂浓度高，对微血管内皮细胞损伤重，血管通透性破坏重，皮下疏松结缔组织的渗出严重，水肿严重。但由这种原因形成的水肿经过一定时间易吸收、消退，长时间后皮肤外貌良好。

小鼠激光照射后40d处死，T6～T9组部分治愈小鼠修复的皮肤有瘢痕形成，而且毛发生长也较困难，这可能与光敏剂注射后和激光照射之间间隔时间较长有关。因为光敏剂进入体内后短时间内绝大多数在体循环中，血管中光敏剂浓度高，临床上应用这个机理用光动力疗法治疗鲜红斑痣取得良好的疗效，治疗后皮下的畸形血管受损闭锁而皮肤经修复愈合完好不留瘢痕^［3］；而在1h后光敏剂在血管的浓度越来越低，相对而言皮肤和肿瘤组织中的光敏剂浓度相对增高^［4］，这时再照射激光皮肤及毛囊损伤较重。当焦痂脱落后新生皮肤生长修复时，就很容易形成瘢痕。由此可见光敏剂注入体内后在一定时间范围内，时间越短则越不容易形成瘢痕修复。

部分小鼠在激光治疗后出现荷瘤侧肢体瘫痪，10～15后可以缓慢恢复正常。肢体瘫痪的发生率由T1至T9组逐渐降低。分析其原因可能是由于激光能量直接照射神经，导致神经组织充血、水肿所致。光敏剂经激光照射后发生光化学反应所产生单态氧和氧自由基等毒性物质的作用也不可忽视。光敏剂在刚注入体内时在体内是广泛分布的，激光照射治疗与注入光敏剂之间的间隔时间越短，则光敏剂的选择性就越差，肿瘤周围组织中的光敏剂浓度也就越高，光照后所导致的周围组织水肿就越严重。比较来看以毒性物质的损伤作用为主，因为小鼠的下肢瘫痪是可逆性的，只有个别小鼠出现永久性瘫痪。因此从局部反映角度看，激光照射时间不能间隔时间太短，应当以注射光敏剂后6h、12h、24h和48h较好。

PDT组近期死亡率高达22.2%，其中T1～T5为高。小鼠在激光照射后2～4天死亡的原因，可能是因为（1）光敏剂在肝脏、脾脏和肾脏浓度很高，小鼠本身体积较小，皮肤薄，光照时即使有少许激光照射到这些部位，就可能导致肝、肾功能衰竭而死亡^[5]。（2）在激光照射时我们没有采用麻醉的方式，而是用橡皮筋将小鼠固定在治疗台上，小鼠是在清醒状态下进行激光治疗的，有可能引发小鼠的应激反应导致死亡。我们认为PDT对于小鼠来说是个很严重的创伤，有时甚至是致命的。而类似规模的处理，对于人体来说则是相当轻微的治疗措施，完全称得上微创治疗。

PDT组小鼠肿瘤的复发死亡率为6.5%，而且多发生在T1、T2、T4和T8、T9组。其可能原因是T1、T2荷T4组的三个时段光敏剂尚未在肿瘤组织中高度浓集，肿瘤的杀伤主要依靠PDT作用肿瘤血管损伤栓塞导致的供血不足，激光照射的总体效应尚不足以彻底杀灭全部肿瘤细胞，残留的肿瘤细胞会引起肿瘤复发或转移；而T8、T9组则可能因为光敏剂在注入体内后，小鼠肿瘤组织中由于较其他组长时间代谢的原因导致浓度比其它组减少，此时未必都能彻底杀灭所有的肿瘤细胞，有些残留的肿瘤细胞仅发生了可逆性的光敏损伤，经过修复，最终引起肿瘤复发和转移。因此，注入光敏剂后过早或者过晚激光照射治疗都有可能会发生肿瘤细胞残留复发的现象。从PDT组小鼠长期存活结果可看出，PDT治疗的最佳时间间隔应当选择在注射光敏剂后6h、12h和24h。

对小鼠的肿瘤标本进行光镜和电镜观察看到，正常肿瘤组织从外向内分三个条带,实验中所观察到的从T1～T9各组肿瘤细胞坏死程度比较一致，并没有出现随注射光敏剂和激光照射之间间隔时间延长而坏死加重的现象，或者6h后各组肿瘤细胞坏死程度加重的现象。这可能是由于在输注光敏剂后1h之内，光敏剂在肿瘤组织中的浓度已经达到很高的水平，并足以杀灭肿瘤细胞；另外肿瘤灶太小，也可导致T1～T9组肿瘤细胞坏死无差异，无法充分体现各组间的PDT效果。从光镜对各组组织学观察来看，注射光敏剂后的短时间内（T1～T5），肿瘤杀伤是以肿瘤组织血管损伤、血栓形成为主，在实验中血管栓塞闭锁在T1～T5组比较常见；而在注射光敏剂后期(T6～T9)则是以肿瘤组织中的单态氧和氧自由基占主导地位。电镜观察则即刻处死小鼠绝大部分细胞只是出现程度不等的线粒体肿胀^[6]，其中以T3、T4和T5组中线粒体肿胀最为明显。而48h处死组肿瘤细胞坏死明显，各组间无差异，结果与光镜检查结果类似。

总结实验结果证实，PDT氧自由基和单态氧直接杀伤肿瘤细胞的作用，和血管损伤引起的间接作用，两者可能都起作用，而靠单一作用可能是不够的。注射光敏剂后6～12h激光照射的效果最明显，此时肿瘤组织中的光敏剂浓度最高，PDT效率高，对正常组织影响小。如果能在这个时段光照前30min再给以适量光敏剂，则可显著提高血浆中光敏剂的浓度，增强血管损伤、血栓形成的间接肿瘤杀伤作用，进一步提高PDT的疗效，这有待于今后动物实验的深入研究。

 

参考文献

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[3]顾瑛，刘凡光，王开，等。光动力疗法治疗鲜红斑痣1216例临床分析[J].  中国激光医学杂志, 2001,10：86-88.

[4] Nagahik Yumita, Nobuo Okuyama, Kazuaki Sasaki, et al. Sonodynamic  therapy on chemically induced mammanry tumor:Pharmacokinetics, tisse distributeon and sonodynamically induced antitumor effet of porfimer sodium. Cancer Sci,  2004,95:765-769.

[5] Ronghui Luo, Zhenqi Diao, Wanhua Liu. The PDT affection to survival of mouse with tumor[J]. Applied Laser, 2001,21(5):358-360

[6] Zhida Lu, Ming Bian, Xinjian Zhang, et al. Electron microscope observation of HPD-laser PDT to S180 cells action[J]. J Chines Med, 1983,63:336-338.