单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞

【摘要】 目的 构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53，并研究其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。方法 利用基因工程技术，将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA（0.5kb）亚克隆至pIRES载体中，通过PCR、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中，并筛选出阳性克隆，流式细胞仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期；逆转录PCR（RT-PCR）和Western bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果 成功构建出双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53。转染后瘤细胞形态由转染前密集排列的多角形、星形转变为排列稀疏的长梭形细胞，瘤细胞生长速度较前缓慢，群体倍增时间比转染前增加了2.3倍，且易出现脱壁并见散在瘤细胞调亡；流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G₁期；RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达，转染MG-63后24h、48h、72h、96h瘤细胞生长抑制率分别为：33.43%、69.37%、66.19%、75.26%，差异有显著性（p＜0.01）。结论 野生型p53和p14ARF协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的调亡，为进一步研究p14ARF与p53在骨肉瘤基因治疗的体内实验奠定了基础。武汉协和医院小儿骨科李进

【关键词】pIRES-p14ARF-p53;凋亡；基因治疗；生长抑制