5羟甲基胞嘧啶：人类基因组的第六碱基

数十年前就知道，哺乳动物DNA胞嘧啶碱基有两种修饰：5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。这些年来，5 mC得到广泛的研究，作为一种稳定且重要的表遗传修饰，参与基因表达调控、X-染色体失活、基因组印记、转座子的长期沉默和癌症的发生，被称为基因组第五碱基；而5羟甲基胞嘧啶的存在，由于技术的限制，一直未能得到确认，近年来应用高精确的质谱分析，情况才得以改观；同时还发现5羟甲基胞嘧啶的形成与恶性血液肿瘤相关，促进了这方面的研究，很快就其生物合成、功能、肿瘤临床应用研究和检测技术等取得一系列重要进展[1-3]，现作简要评述。 江苏省肿瘤医院肿瘤内科薛开先

1 生物学合成

    近年来的一系列研究表明，TET（Ten-Eleven-Translocation 10-11易位)家族的氧合酶催化5mC向5hmC转换，其生物学过程参见图1。作为DNA组成的胞嘧啶，是在复制时由游离胞嘧啶掺入，复制后通过DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases DNMT) 类的作用，利用腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine SAM)作为甲基供体，在胞嘧啶碱基5位上添加甲基，从而形成5甲基胞嘧啶。进而在TET家族蛋白作用下，利用分子氧转移羟基至5甲基胞嘧啶，形成5羟甲基胞嘧啶[1,4]。

          胞嘧啶            5甲基胞嘧啶                  5羟甲基胞嘧

     （Cytosine C）   (5-methylcytosine 5mC)    (hydroxymethylcytosine 5hmC)

图1 哺乳动物DNA胞嘧啶及其修饰的生物学过程

(图未能正确复制)

由5甲基胞嘧啶合成5羟甲基胞嘧啶的关键分子是TET家族蛋白。在急性髓系白血病TET1基因是MLL基因易位的融合伙伴，它们分别定位于染色体10q24和11q23。TET蛋白是一种2-酮戊二酸（2 - oxoglutarate 2OG ） 和Fe（II）依赖性酶，研究证明，它能在培养细胞和体外催化5甲基胞嘧啶转换成5 羟甲基胞嘧啶。 5羟甲基胞嘧啶存在于小鼠胚胎干细胞基因组，用RNA干扰耗尽TET1后，5羟甲基胞嘧啶的水平下降；并认为，通过TET蛋白将5甲基胞嘧啶修饰成5羟甲基胞嘧啶后，应具有潜在的表遗传调控作用[1，4]。

2在基因组和不同组织中的分布和功能

2.1.1 在哺乳动物基因组分布   哺乳动物基因组中胞嘧啶甲基化标志非随机分布，与其功能密切相关。例如，5mC参与基因表达调节，多位于基因调控区如启动子等序列中的CpG二核苷酸中；而大部分的5甲基胞嘧啶则位于转座子，后者是因组中的重复序列，可损害基因组的功能和稳定性，当各种类型的转座子被密集甲基化后，其活性在所有类型细胞中被沉默[1]。由于5mC与5hmC高度相似，目前常用的、基于亚硫酸氢盐的技术不能区分这两种修饰，因此迫切需要开发特异性的、检测5hmC的基因组技术，目前已取得一些进展 [5]。

    最近研究表明，5hmC是哺乳动物DNA的一种稳定修饰，被称之为基因组第六碱基[2]。5hmC是由5mC经酶氧化后形成。5mC是一种重要的表遗传学修饰，负调控基因表达，推测5hmC亦有相似的作用。最近的实验研究，使用模型底物包括巨细胞病毒（cytomegalovirus CMV）IV（immediate early 立即早期）基因启动子和一个通用的基因体（gene body），直接在体外评估启动子和基因体5 hmC对转录的效应。结果表明，5hmC修饰的存在强烈抑制转录；结果还表明，抑制转录活动主要是由于启动子中5hmC的存在，基因体中5hmC对转录仅有很小的效应。因此可以认为，启动子中5hmC的存在阻止了基本转录因子的结合，或募集了抑制转录的因子[5]。这方面的研究尚待深入。

2.1.2 在不同不同组织中的分布  1972年首先在成年鼠和蛙类的大脑报告了5hmC的存在，约占提取DNA中总胞嘧啶的~15%，后因未能被重复，此后30多年间一直未得到应有的关注。2009年新技术的应用，才开始积累了关于5hmC在各种组织中分布的、有价值的资料[1]。如有作者应用HPLC-MS和免疫组织化学的显示，hmC是存在于所有组织和细胞类型，在中枢神经系统的神经细胞中有最高的浓度[6]。

最近应用新研制的5hmC免疫学技术，确定5-hmC在人体组织中丰度，并比较在正常与癌性大肠癌组织间的5hmC状态。观察到不同组织间的5hmC含量有显著差异。检测到5hmC占总核苷酸比率高的是在脑、肝,肾和结肠癌组织(0.40-0.65%)，相对较低的是肺(0.18%)和极低的心脏、乳腺及胎盘(0.05-0.06%)。与正常大肠组织(0.46 - 0.57%)相比，大肠癌组织的5hmC丰度显著降低(0.02-0.06%)。上述结果首次显示, 在人体组织中5-hmC分布是组织依赖性的，其丰度在疾病状态如大肠癌可被改变[7]。

另一组作者应用免疫组织化学检测方法，研究5hmC在一大组鼠和人体组织中的分布，发现大部分胚胎干细胞和成体组织富含5hmC；在多层次、有序的组织中，5hmC的水平密切关系到细胞的分化状态。最高水平的5hmC是在终末分化细胞，而在较少分化的组织干细胞/祖细胞部分有很低5hmC水平；而且与正常组织比较，在多种癌组织5hmC水平显著下降。结果显示，5hmC在组织分化中发挥重要作用，并在癌组织中5hmC大量丢失[8]。

2.2 干细胞   干细胞是指具有自我更新能力而长存、并能分化生成各种功能细胞的多能性细胞。在机体发育、再生和修复中具有重要作用。为保持干细胞自我更新和分化间的平衡，协调基因表达是至关重要的。这一精确平衡系统的紊乱可导致各种恶性疾病。哺乳动物DNA胞嘧啶的5甲基化（5mC）参与平衡基因表达的调控，并与恶性肿瘤的发生相关；催化5mC向 5hmC转换的TET家族成员，在胚胎干细胞自我更新和维持，以及内细胞团（ICM）细胞的特化中发挥作用[1，9]。

最近在大部分髓系恶性血液病中发现，TET基因家族反复发生缺失和体细胞突变，而且发现低水平基因组5hmC与TET2突变之间存在相关。而TET基因编码的蛋白能羟基化5mC，这些资料进一步证明TET蛋白与5hmC生物合成相关，还提示DNA甲基化的动态改变，在干细胞分化与转化的调节中起关键作用[9，10]。

2.3  DNA去甲基化   胞嘧啶甲基化是哺乳动物的DNA的主要表遗传修饰。虽有证据显示，主动DNA去甲基化发生在动物细胞，但这一过程细节还未明确。最近发现TET1-3蛋白家族是5mC羟化酶类，一些作者假定，所形成的5hmC是主动去甲基化过程中的早期中间体 [11]。最近在体外和培养细胞中研究表明，DNA的5mC和5hmC能被TET双加氧酶氧化成5羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine 5caC)，5caC能被胸腺嘧啶-DNA转葡糖基酶(thymine-DNA glycosylase TDG)特异性地识别并切除。在小鼠胚胎干细胞TDG耗尽导致5caC的积聚，并易被检出。上述资料提示，通过TET蛋白的5mC氧化，和随后TDG介导的5caC的切除，构成了主动DNA去甲基化的一种途径[12]。

最近研究表明，TET蛋白除能将5mC 转换成5hmC外，还能以依赖酶活性的方式产生5甲酰胞嘧啶(5-formyl-cytosine 5fC) 和5caC；在小鼠胚胎干细胞和器官中发现5fC和5caC的存在，5hmC、5fC和5caC的基因组含量随TET蛋白的过度表达和耗尽而增减。这些在体内的研究结果也提示，DNA去甲基化可能性是通过TET催化的氧化和随后的脱羧作用而发生[13]。

2.4 介导环境因素的效应   许多环境毒物如重金属、空气中微粒、臭氧等诱导氧化应激，并降低驱动合成生化反应的辅酶I和辅酶II的水平，从而降低了应对氧化应激的能力。最近发现TET蛋白能氧化DNA中5mC成为5hmC，这是在高氧条件下被α酮戊二酸激活，后者是在柠檬酸循环中有氧代谢产生的辅因子。 TET是Jumonji家族的组蛋白去甲基酶和脯氨酰羟化酶，后者是一种高氧条件下低氧诱导因子（hypoxia-inducible factor HIF1a）的抑制因子，它们的激活都需要α酮戊二酸作为辅因子。似乎具有对立功能的HIF1a和TET蛋白质影响生命过程的多个方面，包括细胞生长调节、胚胎干细胞的维持、细胞分化和肿瘤发生。新陈代谢对调节整体DNA甲基化和染色质组织化的作用，最近受到生物医学研究界的更多关注。这些研究表明，TET激活和5hmC和5mC水平在环境应激反应中发挥的作用，并有可能成为一个有益的、接触环境毒物的生物标志物[14]。

3 在肿瘤研究中应用

TET家族氧合酶催化5mC向5hmC转换， TET2在髓系癌前或恶性血液病，如骨髓发育不良、骨髓增生综合征和急性髓性白血病等中频发突变，以及在前列腺癌、乳腺癌和结肠癌等亦发现5hmC水平显著下降。这些促进了学术界对5hmC研究的日益关注和重新认识[1，7，15]。 

骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndromes MDS)的癌变途径知之甚少，有研究在96患者中有22例鉴定出TET基因的移码、无义、错义突变或存在基因的结构缺陷。突变和无突变患者在最初的临床和血液学参数并没有显着差异，但两组的5年总生存率有非常显著差异，分别为76.9.0％和18.3％（P = 0.005）；3年无白血病生存率分别为89.3％和63.7％，亦有显著差异（P = 0.035）。在单因素分析时，不存在TET2突变的患者增加4.1倍死亡风险（P = 0.009）。在调整年龄等因素的多变量分析， TET2突变的存在仍然是良好预后的独立因素（危险比为5.2 ；95％CI为1.6-16.3；p = 0.005）[16]。 

另一组作者在骨髓增生异常综合征和多种髓系白血病中研究表明，TET2基因经常发生微缺失和基因突变等遗传学改变，同时降低骨髓细胞基因组的hmC水平；如用RNA干扰耗尽小鼠造血前体中的Tet2，偏斜其向单核/巨噬细胞谱系的分化。这些研究表明，TET2对正常骨髓细胞生成是重要的，并提示TET2酶活性的破坏有助于骨髓恶性疾病的形成，检测其5hmC水平，可望成为有价值的诊断和预测的工具，来定制治疗方案和评估抗癌药物反应[17]。

在急性髓细胞白血病TET基因的错码突变，可在10-25%缺乏IDH1/2（isocitrate dehydrpgenase 1/2 异柠檬酸脱氢酶1/2）基因突变的患者中检出。大部分最低分级的弥漫性神经胶质瘤携带IDH1/2突变，但是没有IDH1/2突变的神经胶质瘤发病分子机理尚待阐明，因此有作者检测这些患者的TET2错码突变，结果未获证据；应用甲基化特异性PCR却在3/35患者中发现TET2启动子甲基化，而在38例存在IDH1/2基因突变的、低分级的弥漫性神经胶质瘤中，没有1例存在TET2基因启动子甲基化(p = 0.0216)。上述结果表明，在一小部分缺乏基因IDH1/2突变的、低分级的弥漫性神经胶质瘤中，TET2基因启动子的甲基化，可能是另一种病理机制[18]。

4 鉴定基因组DNA5hmC方法的研究

    进一步研究5hmC的基因组特异性分布和功能，受到技术上的限制，因为以往广泛应用的、基于亚硫酸氢盐的技术不能区分5mC和5hmC[6，19]。经近几年的努力，最近多组研究者报告了成功检测5hmC的新技术。

Robertson等最近报告了一种经济、快速鉴定hmC基因组分布的方法。原理是野生型T4噬菌体DNAM几乎不含有胞嘧啶，取而代之的是5hmC，它能被T4 编码的α-或 β-葡萄糖基转移酶进行葡萄糖基化，后者在体外葡萄糖基化试验时更为有效的。于是在测试中用来自T4噬菌体的β-葡萄糖基转移酶，使5hmC选择性地葡萄糖基化，产生β-葡萄糖基-5羟甲基胞嘧啶(β-glucosyl-5-hydroxymethylcytosine β-glu-5hmC)。β-glu-5hmC修饰提供了偶联在磁珠上J-结合蛋白的捕获靶位。被沉淀的DNA适合进行定量PCR、微阵列或测序。我们还表明，J-结合蛋白捕获试验能鉴定人胚胎干细胞发育调控基因启动子的羟甲基胞嘧啶。本法将能有助于理解5hmC在单基因水平的、有关表遗传学调控的时空效应[19]。

Flusberg BA报告了单分子实时(single-milecule,real-time SMRT)测序时，直接检测包括5hmC在内的多种DNA甲基化。在SMRT测序时，DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入互补的核酸链。所形成荧光脉冲的到达时间和持续时间，产生了聚合酶动力学信息，并允许直接检测DNA模板中修饰核苷酸，包括N6 ?甲基腺嘌呤（methyladenine）、5甲基胞嘧啶和5 ?羟甲基胞嘧啶。不同的修饰差别影响聚合酶的动力学，使之能彼此之间相互区别。此方法适合长时间阅读，甚至可能在高度重复基因组区域对甲基化模式作图[20]。

参考资料

1．Dahl C. Grønbæk K. Guldberg P. Advances in DNA methylation: 5-hydroxymethylcytosine revisited. Clinica chimica acta.2011；412（11-12）：831-836.

2．Münzel M. Globisch D. Carell T. 5-Hydroxymethylcytosine, the Sixth Base of the Genome.

Angew Chem Int Ed Engl. 2011; 50(29) :6460-6468. 

3．Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 2009; 324(5929): 930-935.

4．Kim YH. Pierscianek D. Mittelbronn M. et al. TET2 promoter methylation in low-grade diffuse gliomas lacking IDH1/2 mutations. Journal of clinical pathology.2011; 64(10): 850-852.

5．Robertson J. Robertson AB. Klungland A. The presence of 5-hydroxymethylcytosine at the gene promoter and not in the gene body negatively regulates gene expression. Biochemical and biophysical research communications. 2011；411（1）：40-43.

6．Globisch D. Münzel M. Müller M. et al. Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates. PloS one. 2010; 5(12): e15367

7. Ndlovu MN. Denis H. Fuks F. Exposing the DNA methylome iceberg.Trends Biochem Sci. 2011; 36(7): 381-387.

8. Haffner MC. Chaux A. Meeker AK. et al. Global 5-hydroxymethylcytosine content is significantly reduced in tissue stem/progenitor cell compartments and in human cancers.

Oncotarget.2011; 2(8): 627-637.

9. Mohr F, Döhner K, Buske C, et al. TET genes: new players in DNA demethylation and important determinants for stemness. Exp Hematol. 2011;39(3): 272-281

10. Cimmino L, Abdel-Wahab O, Levine RL, TET Family Proteins and Their Role in Stem Cell Differentiation andTransformation. Cell Stem Cell. 2011; 9(3): 193-204.

11．Guo JU, Su Y, Zhong C, et al. Emerging roles of TET proteins and 5-hydroxymethylcytosines in active DNA demethylation and beyond. Cell Cycle. 2011;10(16): 2662-2668.

12．He YF, Li BZ, Li Z, Liu P,et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 2011 Sep 2;333(6047):1303-1307.

13. Ito S, Shen L, Dai Q, et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 2011 Sep 2;333(6047):1300-3.

14. Wang L. Chia NC. Lu X. et al. Hypothesis: Environmental regulation of 5-Hydroxymethylcytosine by oxidative stress. Epigenetics. 2011 Jul;6(7):853-6.

15.Holmfeldt L, Mullighan CG. The role of TET2 in hematologic neoplasms. Cancer Cell. 2011; 20(1): 1-2.

16．Kosmider O. Gelsi-Boyer V. Cheok M. et al. TET2 mutation is an independent favorable prognostic factor in myelodysplastic syndromes (MDSs). Blood. 2009114 (15): 3285-3291.

17. Ko M, Huang Y, Jankowska AM, et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 2010 Dec 9;468(7325):839-43.

18. Kim YH. Pierscianek D. Mittelbronn M. et al. TET2 promoter methylation in low-grade diffuse gliomas lacking IDH1/2 mutations. Journal of clinical pathology.2011;64(10): 850-852.

19. Robertson AB, Dahl JA, Vågbø CB, et al. A novel method for the efficient and selective identification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 2011; 39(8): e55.

20. Flusberg BA. Direct detection of DNA methylation during single-molecule, real-time sequencing. Nature methods. 2010；7（6）：461-465