肿瘤表基因组研究

 

 近年来以下一代测序技术(next-generation sequencing ngs)为代表的、大规模、高通量基因组技术的迅速发展，对人类表基因组的认识不断深化，促进了该研究领域的新发现，和对重要研究问题的重新认识^[1-3] ；同时为癌症病因、诊断、预防和制定新的治疗策略提供了新的机遇^[1]。现对其中一些重要进展简要述评。江苏省肿瘤医院肿瘤内科薛开先

1 概述

1.1 基因组与表基因组   基因组是机体遗传信息的总和，在哺乳动物是单倍体（全套）染色体组，其中包括编码（基因）和非编码（但可编码调节rna等）的dna序列，是性状发育和疾病易感性的重要内因。在个体发育和疾病发生中，不同性质、动态的环境因素，通过表基因组作用于相对静态的基因组，在它们不断的相互作用中，性状形成和包括癌症在内的各种疾病发生；近年来在这些复杂的互作中，表基因组作为介导和重要内因，其作用机制和意义受到日益关注^[1，4，5]。

 

    表基因组是遗传信息载体?染色质生化修饰的总和。在个体发育中胚胎细胞具有相同的基因组，但在表遗传学机制调控下，通过分化产生不同结构、功能的组织细胞，它们彼此之间具有各别的表基因组，故表基因组是调控基因表达的模式，也是一类细胞的总体表遗传学状态。可见，在胚胎发育中一种基因组可以产生许多不同类型的表基因组^[6，7]。

与基因组比较，表基因组更为动态，这反映了细胞处于不同时空时的功能状态。这一动态改变是受表基因组可逆的共价修饰如dna甲基化和组蛋白修饰所调控；另外一些机制是非共价修饰如微rna和染色质重塑复合物等。目前许多作者认为，表基因组是由dna甲基化、组蛋白修饰、染色质构型和的非编码rna组成；如从基因组水平进行研究，它们就分别构成了dna甲基化组、组蛋白修饰组以及小rna组等，目前研究最多的是甲基化组^[8-10]。

1.2 dna甲基化组   dna甲基化是首先发现的、其复制机制比较明确的一种表遗传修饰。dna甲基化是真核基因组的普遍的特征，并是细胞分化过程和转录潜能调控的基本且重要的表遗传学层次。 dna甲基化模式能被遗传，但又是动态的，可以受到环境、饮食和衰老的影响，在疾病发生中被紊乱。在哺乳动物基因组正常的dna甲基化模式，对发育和健康有重要意义[11-13]。

     dna甲基化组是检测涵盖整个基因组的甲基化胞嘧啶组成与分布状况，并研究这些特征与基因表

 

达、细胞分化、衰老和肿瘤等疾病发生的关系。长期来由于技术的限制，只能在个别或少数基因水平进行研究。近年来由于下一代测序等新技术的开发，再加上分子生物技术，使之有可能获得单核苷酸分辨水平的、全基因组dna修饰的特征谱，分析研究后有了新发现，真核生物具有高度保守的、基因体（gene body）的高度甲基化，以及以往曾未关注序列中存在的dna甲基化；还重新确认存在另一种修饰的碱基：5-羟甲基胞嘧啶。这些发现将有助于进一步阐明dna甲基化组的正常和病理功能^[12，13]。

 

1.3  新研究方法的开发    癌症的发生是遗传学和表遗传学改变积累的结果，细胞的癌变应在基因组水平阐明相关基因在功能上如何相互作用，决定了肿瘤启动和演进的不同生物学和临床路径；这就需要进行全面、综合的遗传学和表遗传学分析，包括30亿核苷酸基因组中相关区域的测序；并在单核苷酸分辨率水平上，确定在不同类型肿瘤的0.28亿cpg二核苷酸的甲基化状态和组蛋白修饰等，而以往的测序方法的昂贵经费和技术上局限性，不可能完成这样的研究^[14，15]。

2005年大规模并行焦磷酸测序平台的出现，进入了称为下一代测序的新时代，这些使遗传学和表遗传学研究大为改观，因为一次实验可产生数亿碱基的序列信息，比以往常用的、双脱氧链终止测序法的效率提高了100多倍；同时检测成本大幅度下降，据估计不久即可实现，约需1000美元就可完成对个体基因组的测序[15-17]。

下一代测序技术将表基因组研究带到现代科学研究的前沿。大规模并行测序效率与创新的分子和计算机动技术偶联，就能以仅在几年前难以想象的分辩率分析表基因组。如结合用于检测全基因组组蛋白修饰，提高微阵列为基础传统方法(chip-chip)效率；同样应用下一代测序技术完成了第一个人类dna甲基化组作图。更重要的是利用下一代测序技术，dna甲基化和组蛋白修饰的研究取得了新发现，并改善了我们关于人类生物学和疾病的知识，例如非cg的胞嘧啶甲基化和5-羟甲基胞嘧啶的发现等，这些将在下文简介^[18,19]。

2 表基因组与环境和疾病

2.1 环境表基因组    环境表基因组是研究环境对表基因组的影响，以及这些因素对人类健康的联合效应。积累的资料表明，表基因组可作为环境与基因组间相互作用的界面，并通过表遗传学的分子机制，将环境和基因型与表型和疾病连接起来[20-22]。

    表基因组介导了动态的环境和静态的基因组之间的连接。基因组的dna序列是遗传决定的，在所有的组织中都相同；表基因组在发育过程中塑造，通过高度组织化的过程，形成了机体不同类型组织细胞的、基因表达编程的多样性；同时表基因组是一个灵敏的反应系统，主要通过dna甲基化、组蛋白修饰和小调节rna等表遗传学改变，感知和反映环境的变化。表遗传变异与基因多态性一样具有类似的后果，导致基因功能的改变，并在随后的生命过程中保持[23，24]。

在由表基因组介导的、基因组与其环境相互作用的复杂网络中，转录因子、染色质和染色质修饰酶是其组成要素，其中dna序列参与结构域水平的染色质组织化；转录因子识别、结合于特殊的dna序列，并通过蛋白质间相互作用，募集染色质调节因子至特定基因；参与表遗传学调控修饰的关键成分是蛋白质修饰酶家族，它们对许多代谢和环境因子是敏感的，通过形成适当的表遗传学修饰，调控染色质的结构和功能。这些酶和“阅读”这些修饰的蛋白质构成了一个复杂的系统，藉此环境因子如化学毒物和食物成分能直接影响基因表达的模式^[25-27]。

2.2 表基因组与疾病   许多环境因素包括从营养到环境毒素，在发育关键期能促成表遗传学改变，例如dna甲基化模式的改变能在细胞分裂后保留，因此改变模式随着时间的推移而积累，结果促成了细胞群体的、持久的表基因组改变，从而改变基因表达模式和细胞表型。这些表基因组状态改变不仅可影响日后、甚至后代的成年疾病的发生和表型^[20，22]。

    在发育敏感或关键期，营养或代谢编程呈现发育可塑性，即同一种基因型在应答不同环境时，可产生维持终生的、在一定范围内的不同生理状态和形态特征。发育关键期包括怀孕、新生儿发育、青春和老年期，因为这些生命阶段对环境改变比较敏感，尤其是早期发育的胎儿，最易受到环境因素的影响，因为在早期发育期dna合成速率高，对正常组织发育所必需的、精致的dna甲基化模式正在建立中。已有研究表明，在怀孕和新生儿阶段，营养和其他环境因素影响细胞可塑性, 因此改变了对成年心血管疾病、2型糖尿病、肥胖症和其他慢性病的易感性[28]。

动态的表基因组不仅应答发育关键期、而且也应答整个生存期的环境信号，不仅熟知的化学品、而且所承受社会行为的影响如母亲关照等都能影响表基因组。接触的不同环境因子可能导致表型的多样性，以及对疾病和行为病征的不同易感性。表遗传学状态的个体差异也影响对异生物质的易感性，随着肿瘤表遗传学研究的深入，认识到表遗传学机制对异生物质毒性作用研究的重要性，为了人类的安全，可以期待在不久的未来，表遗传学将进入化学品的安全性评价体系[5]。

3 癌症表基因组的研究

3.1 癌症的表基因组改变    细胞核内的dna甲基化、组蛋白修饰和染色质高阶组织化是表基因组的组成部分，其中染色质高阶组织化包括核小体定位和染色质结构域的核内定位，这些使复杂性呈指数增加。在发育、分化和成体阶段，不同组织基因表达的表遗传学调控是细胞类型特异性的，呈现不同的表基因组状态。包括癌症在内的各种疾病，几乎无一例外地发生表基因组状态改变。已如上述，由于近年来高通量新技术的开发，提供了快速、可靠和经济的全表基因组分析的方法^[29]，促进这一领域的研究，现以几种常见癌症为例，简介癌症表基因组研究的一些进展。

大肠癌是异质性疾病。对125例大肠癌和29份邻近组织，作全基因组dna特征谱分析，区分出四种不同生物学特性的亚型，显示独有的遗传学和临床特点。① 高cpg岛促甲基化表型 (cpg island methylator phenotype cimp)亚型：同时有多个基因存在特别高频率的、癌特异性的高甲基化，并与mlh1 dna高甲基化和braf突变呈现强相关；② 低cimp亚型：富集kras突变；③ 非cimp肿瘤，特有显著高频率的tp53突变，肿瘤多发生在末端结肠；④非cimp肿瘤，但显示有低频率的、癌特异性的dna高甲基化和基因突变，肿瘤显著多见于直肠。进一步在高cimp、加上有启动子高甲基化的肿瘤中，鉴定出下调表达超过两倍的112基因。这代表在高cimp肿瘤中获得启动子高甲基化基因的7%。感兴趣的是，48/112基因在非cimp亚型中也被转录下调，但这不能归因于启动子高甲基化^[30]。

应用甲基化dna免疫沉淀结合高通量测序，研究了8株人乳腺癌细胞系和正常人类乳腺上皮细胞的全基因组dna甲基化特征，分析可产生无偏的、几乎涵盖整个基因组的dna甲基化图谱，并具有足够的深度和分辨率。与人乳腺上皮细胞相比，乳腺癌细胞系最显著的特点是显著地降低了甲基化水平，特别是在cpg 贫乏区域；高甲基化优先发生在富含cpg基因的相关的区域，与转录起始位点的距离无关。我们还研究了mcf7细胞从上皮到间质转化过程中的甲基化组的改变，主要与基因连接的cpg富集区的、甲基化模式的特异性改变相关。此外在相关基因区域约40%上皮细胞特异性甲基化模式，改变成典型的间质细胞模式，显示dna甲基化对细胞类型特异性的调控^[31]。

3.2表基因组与致癌作用  现以与生活方式相关的吸烟与过量饮酒为例，说明它们的致癌作用与引发的表基因组改变密切相关。

正常人体小呼吸道上皮细胞和永生人支气管上皮细胞系，在有或无香烟烟雾冷凝物（cigarette smoke condensate csc）培养基中培养9个月。western印迹分析表明，csc介导的、剂量和时间依赖性的h4k16ac和h4k20me3减少，同时增加h3k27me3的相对水平；这些组蛋白的改变与降低的dna甲基转移酶1（dnmt1）表达和增加的dnmt3b表达相一致。焦磷酸测序和定量rt - pcr实验结果显示，时间依赖性的d4z4、nbl2和line - 1重复dna序列的低甲基化；h19, igf2, mage-a1和 d mage-a3的表达上调； wnt信号激活以及在人类肺癌经常沉默的、肿瘤抑制基因如rassf1a和β?rar的高甲基化。在从csc暴露永生人支气管上皮细胞衍生出软琼脂克隆，基于阵列法的dna甲基化分析，确定了额外、新的dna甲基化靶标，还在这些细胞中鉴定出csc基因表达的特征谱。csc诱发的基因组低甲基化和局部dna的高甲基化，与在软琼脂克隆形成的急剧增加相一致。上述数据说明，在培养的呼吸道上皮细胞，吸烟诱发了癌症相关表基因组的改变；提示吸烟致癌与表基因组改变密切相关^32]。

 

叶酸是b族维生素的成员，是嘌呤和嘧啶的合成以及基本生物活性物质的甲基化所需要的，后者包括磷脂、dna和神经递质。哺乳动物不能从头合成叶酸，因此一个有效的肠道吸收和运输过程是必需的。叶酸摄取和运输的任何损害可导致叶酸缺乏的状态。研究表明，乙醇过多摄入是叶酸缺乏的主要原因，可引起肠吸收不良、改变肝胆代谢、增强结肠代谢和肾排泄。维持细胞的叶酸内稳态，对于一碳转移反应是至关重要的，后者是dna合成和生物甲基化反应所必需的。甲基化是基因表达、维持dna的完整性和稳定性、染色质修饰和突变发生中的重要的表遗传决定因素。乙醇影响dna甲基化的机制，除可通过引发叶酸缺乏影响dna甲基化外，乙醇还可通过直接与一碳代谢的相互作用，损害甲基合成；以及影响调节s -腺苷甲硫氨酸（最主要的甲基供体）dna合成的酶。因此，乙醇可通影响生物分子甲基化的能力，从而影响包括癌症在内的多种疾病的发病风险^[33]。

 

3.3 表基因组与肿瘤的药物开发和化学预防  表遗传学是研究没有dna序列变化的、可遗传的表型改变。表遗传学机制通过对染色质结构基质成分：dna、组蛋白、非组蛋白和ncrna的修饰，介导对基因沉默和激活的调控，改变基因表达模式，进而显著改变细胞表型。表遗传学机制在肿瘤发生和演进中起重要作用，而引发的肿瘤表基因组改变是潜在可塑的，这就为肿瘤表遗传学治疗和预防提供了理论基础^[34，35]。

    未来的药物设计和新疗法的开发，依赖于我们揭示正常和疾病状态的、表基因组复杂性的能力。在胚胎发生和发育中，适当的表遗传调控是正常分化的关键；相反，不正常的表遗传调控是癌症、糖尿病和心脏病等复杂疾病的特征。表遗传学治疗的应用范围广泛，从癌症药物治疗到诱导建立多能干细胞。要创建更特异和有效的治疗方法，这需要更全面地理解表基因组景观（epigenomic landscapes）^[35]。

目前已有多种基于表遗传学原理合成的药物，可以降低dna高甲基化和组蛋白去乙酰化，正处于临床前和临床试验之中，然而这些化学物质一般都有较大的毒性，并且没有基因的特异性，故近来较多作者研究，将能调整表遗传学事件的生物活性物质用于化学预防^[36]。

已报告的、作用机制在于表基因组的化学预防因子，包括微营养素有叶酸、硒、类维生素a和维生素e等；来自绿茶、苹果、咖啡和其他食物有多酚类和丁酸盐等；来自大豆的染料木黄酮，来自植物食品的异硫氰酸盐类、来自姜黄根的姜黄素、来自葡萄的白藜芦醇和来自十字花科的蔬菜莱菔硫烷等。其中影响去乙酰化酶（sirtuin ）活性的化合物有白藜芦醇,组蛋白乙酰化抑制剂有鸡腰果酸和熊去氧胆酸等,以及相对研究较少的组蛋白赖氨酸甲基化的调节剂有毛壳素、多胺类似物和n-3多不饱和脂肪酸等^{[34，36，37]}。

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