人参和泼尼松对关木通致大鼠急性肾毒性的干预作用（1）

人参与强的松对关木通致大鼠
急性肾毒性的干预作用
      郭彦聪（1）李荣芬（2）王小光（3）郭彦锐（3）高连发

 

发表于《中国中西医结合急救杂志》2005.12（5）保定市第一中心医院肾脏内科郭彦聪
摘   要
     目的：探讨中药人参和强的松对关木通所致的急性肾毒性的干预作用。方法：54只清洁级雌性SD大鼠，分别给以关木通煎剂40g/kgd，关木通煎剂40g/kgd和强的松30mg/kgd，关木通煎剂40g/kgd和生晒参煎剂40g/kgd，关木通煎剂40g/kgd、强的松30mg/kgd和生晒参煎剂40g/kgd，灌胃5天。第4、8天，测定血尿生化等指标、免疫组织化学染色和病理切片。用SPSS11.5软件进行统计学处理。结果：含关木通各组大鼠体重和活动能力下降，而BUN、CRE、尿NAG酶、尿β2－M、TGF?1、Ⅳ型胶原、均有不同程度增高,其中关木通组差异最大；与单纯木通组比较，各实验组BUN、CRE、尿NAG酶TGF?1、Ⅳ型胶原有不同程度的降低。结论：单独用人参、强的松和关木通混合灌胃，或同时用人参、强的松和关木通混合灌胃，均减轻关木通对大鼠的急性肾毒性。
    
关键词：马兜铃酸肾病 人参 关木通 强的松 转化生长因子-β1 Ⅳ型胶原 
     自vanheweghem等报道因服减肥药引起“中草药肾病”以来，含马兜铃酸（Aristolochic acid AA）中草药引起的急、慢性肾损害受到了肾脏病学界的广泛重视。对于AA的毒性成分，发病机理已有了比较深入的研究，但在AA肾毒性的防治上尚缺乏深入的研究。为寻找克制马兜铃酸肾毒性的方法，我们用人参（生晒参）和激素（强的松）对急性马兜铃酸肾病大鼠模型进行了干预实验研究。
材料与方法
　　1. 材料
　　1.1中药：关木通、生晒参 购自保定市中药材公司。经鉴定,关木通为马兜铃科植物木通马兜铃（Aristolochia manshuriensis Kom.）的干燥茎，又称关木通。生晒参为五加科多年生草本植物人参（panax ginseng C．A．Mey．）的干燥根。
　　1.2西药：强的松，天津制药集团有限公司药厂生产。
　　1.3实验动物：清洁级SD大鼠，雌性，体重在150-200g，河北医科大学实验动物中心提供。
　　1.4试剂：第一抗体，免抗鼠ＴＧＦβ1多克隆抗体，小鼠抗大鼠Ⅳ型胶原抗体；第二抗体，生物素标记的羊抗兔抗体（SP9001工作液），羊抗小鼠抗体（SP9002工作液）。以上产品购自北京中山生物技术有限公司。
　　2.方法：
　　2.1.关木通、生晒参水煎剂的制备：取关木通1000g，加水适量，使药能完全浸泡，浸泡30-50分钟，文火煎煮30分钟，滤出药液，再加水适量，煎煮30分钟，共煎3次。收集药液，文火浓缩至500ml，即含生药2g/ml,放置冷藏柜备用。生晒参水煎剂的制备同上述方法。
　　2.2.动物的分组与给药方法：A组（关木通组12只）给以关木通煎剂40g/kgd灌胃；B组（关木通合强的松组12只）给以关木通煎剂40g/kgd和强的松30mg/kgd灌胃；D组（关木通合生晒参组12只）给以关木通煎剂40g/kgd和生晒参煎剂40g/kgd灌胃；E组（关木通合强的松、生晒参组12只）给以关木通煎剂40g/kgd、强的松30mg/kgd和生晒参煎剂40g/kgd灌胃；C组（对照组6只）给以生理盐水8ml/d灌胃。每日2次，连续给药5天。
　　2.3.标本的采集： 分别于实验的第4、8天，各处死6只大鼠，之前一天用代谢笼收集各组大鼠24小时尿，测尿量、尿蛋白（考马斯亮蓝法）、尿糖（己糖激酶法），离心，显微镜检查红细胞（RBC）、白细胞（WBC），放免法测定尿NAG酶、β2微球蛋白。后断头取血，分离血清，测定血尿素氮、肌酐，摘取双侧肾脏，去包膜，右肾称重，左肾沿肾蒂纵向切开，10%福而马林液固定，以备免疫组化和光镜检查。
　　2.4免疫组化检查
2.4.1将１０％福尔马林固定的肾组织块，予以酒精脱水，石蜡包埋，制成厚４μm的石蜡切片，作ＨＥ染色PAS染色及免疫组织化学染色。
2.4.2.石蜡切片脱蜡至水。
2.4.3 3%H2O2水室温孵育15钟，以清除内源性过氧化物酶的活性。
2.4.4. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。
2.4.5. 采用微波炉抗原修复法，将切片放入盛有0.01M枸橼酸盐缓冲液（PH 6.0）的容器中，置医用微波炉内加热，温度保持在92℃—98℃之间，持续15分钟。取出容器，室温冷却15分钟，PBS冲洗。
2.4.6. 10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，37℃孵育20分钟。
2.4.7. 倾去血清，滴加1?80稀释的兔抗TGFβ1多克隆抗体，Ⅳ型胶原工作液，37℃孵育60min ，PBS冲洗，5分钟×3次。
2.4.8. 直接滴加二抗工作液，37℃孵育20分钟。PBS冲洗，5分钟×3次。
2.4.9.  3，3′-二氨基联苯胺（3，3′-diaminobenzine,DAB）显色剂显色。
2.4.10. 自来水充分冲洗，复染，封片。
　　3. 结果判定:采用HPIAS－1000高清晰度彩色图象分析系统７.０（同济医科大学千屏影象工程公司）,进行半定量分析。
　　4.统计学处理:数据以均数±标准差表示，所有数据用SＰSＳ11.5统计软件处理，组间差异比较用单因素方差分析。
结    果
　　1.大鼠的生存情况
　　实验第4天，除2只灌胃时误灌气管死亡外，其余大鼠均存活，但A组出现了明显的反应迟钝，竖毛，食量减少等表现。B、D、E组亦有上述表现，但较轻；实验第6天，A组大鼠 开始出现死亡（2只）；除C组外余组均出现明显的反应迟钝，竖毛，食量减少等表现；实验第8天，A组共死亡4只，D、 E组各死亡1只，B组、C组无死亡。B、C、D、E各组与A组比较P?0.05。
　　2.体重、肾重、肾重/体重的变化：
　　从表1可知：与C组相比， A、B、D、E组，大鼠肾重增加；但B、E组无统计学差异；肾重体重比，A组明显增高，其它组增高无统计学差异。
3.尿常规的变化：
　　从表2可知：所有含木通组均出现了尿红细胞、白细胞、尿蛋白和尿糖，个别组出现了管型，其中以A组最严重。
　　4.尿量、尿蛋白和尿糖定量、尿NAG酶和尿β2－M、血肌酐和尿素氮的变化：
　　从表3可知：含木通各组尿量在第4天在均减少，以单纯木通组最严重，至第8天则增多。各实验组尿糖、尿蛋白定量第8天均增加。
　　尿NAG酶在第4天A、B、D组均轻度增高，其中A组增高最明显；第8天时，所有含木通各组的尿NAG酶均明显增高；与A组比较，B、D、E组均有降低；尿β2－M也有不同程度的增高。
　　含木通各组BUN、CRE第8天时均增高,其中A组差异最大，E组差异最小。
　　4.免疫组化肾组织TGF?1、LN、Ⅳ型胶原的变化：从表4可知：第8天时，与C组比较，各组的TGF?1、Ⅳ型胶原有不同程度的升高，有不同程度的升高；与A组比较，B、D、E组均有降低，但只Ｅ组有统计学差异。
　　病理变化各实验组以E组最轻，未见到，但可见肾小管上皮细胞空泡变性，其他组可见基底膜裸露现象；肾小球变化不明显。（见插图）