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- 人参和泼尼松对关木通致大鼠急性肾毒性的干预作用(1)
- 作者:郭彦聪|发布时间:2008-04-17|浏览量:1108次
人参与强的松对关木通致大鼠
急性肾毒性的干预作用
郭彦聪(1)李荣芬(2)王小光(3)郭彦锐(3)高连发
发表于《中国中西医结合急救杂志》2005.12(5)保定市第一中心医院肾脏内科郭彦聪
摘 要
目的:探讨中药人参和强的松对关木通所致的急性肾毒性的干预作用。方法:54只清洁级雌性SD大鼠,分别给以关木通煎剂40g/kgd,关木通煎剂40g/kgd和强的松30mg/kgd,关木通煎剂40g/kgd和生晒参煎剂40g/kgd,关木通煎剂40g/kgd、强的松30mg/kgd和生晒参煎剂40g/kgd,灌胃5天。第4、8天,测定血尿生化等指标、免疫组织化学染色和病理切片。用SPSS11.5软件进行统计学处理。结果:含关木通各组大鼠体重和活动能力下降,而BUN、CRE、尿NAG酶、尿β2-M、TGF?1、Ⅳ型胶原、均有不同程度增高,其中关木通组差异最大;与单纯木通组比较,各实验组BUN、CRE、尿NAG酶TGF?1、Ⅳ型胶原有不同程度的降低。结论:单独用人参、强的松和关木通混合灌胃,或同时用人参、强的松和关木通混合灌胃,均减轻关木通对大鼠的急性肾毒性。
关键词:马兜铃酸肾病 人参 关木通 强的松 转化生长因子-β1 Ⅳ型胶原
自vanheweghem等报道因服减肥药引起“中草药肾病”以来,含马兜铃酸(Aristolochic acid AA)中草药引起的急、慢性肾损害受到了肾脏病学界的广泛重视。对于AA的毒性成分,发病机理已有了比较深入的研究,但在AA肾毒性的防治上尚缺乏深入的研究。为寻找克制马兜铃酸肾毒性的方法,我们用人参(生晒参)和激素(强的松)对急性马兜铃酸肾病大鼠模型进行了干预实验研究。
材料与方法
1. 材料
1.1中药:关木通、生晒参 购自保定市中药材公司。经鉴定,关木通为马兜铃科植物木通马兜铃(Aristolochia manshuriensis Kom.)的干燥茎,又称关木通。生晒参为五加科多年生草本植物人参(panax ginseng C.A.Mey.)的干燥根。
1.2西药:强的松,天津制药集团有限公司药厂生产。
1.3实验动物:清洁级SD大鼠,雌性,体重在150-200g,河北医科大学实验动物中心提供。
1.4试剂:第一抗体,免抗鼠TGFβ1多克隆抗体,小鼠抗大鼠Ⅳ型胶原抗体;第二抗体,生物素标记的羊抗兔抗体(SP9001工作液),羊抗小鼠抗体(SP9002工作液)。以上产品购自北京中山生物技术有限公司。
2.方法:
2.1.关木通、生晒参水煎剂的制备:取关木通1000g,加水适量,使药能完全浸泡,浸泡30-50分钟,文火煎煮30分钟,滤出药液,再加水适量,煎煮30分钟,共煎3次。收集药液,文火浓缩至500ml,即含生药2g/ml,放置冷藏柜备用。生晒参水煎剂的制备同上述方法。
2.2.动物的分组与给药方法:A组(关木通组12只)给以关木通煎剂40g/kgd灌胃;B组(关木通合强的松组12只)给以关木通煎剂40g/kgd和强的松30mg/kgd灌胃;D组(关木通合生晒参组12只)给以关木通煎剂40g/kgd和生晒参煎剂40g/kgd灌胃;E组(关木通合强的松、生晒参组12只)给以关木通煎剂40g/kgd、强的松30mg/kgd和生晒参煎剂40g/kgd灌胃;C组(对照组6只)给以生理盐水8ml/d灌胃。每日2次,连续给药5天。
2.3.标本的采集: 分别于实验的第4、8天,各处死6只大鼠,之前一天用代谢笼收集各组大鼠24小时尿,测尿量、尿蛋白(考马斯亮蓝法)、尿糖(己糖激酶法),离心,显微镜检查红细胞(RBC)、白细胞(WBC),放免法测定尿NAG酶、β2微球蛋白。后断头取血,分离血清,测定血尿素氮、肌酐,摘取双侧肾脏,去包膜,右肾称重,左肾沿肾蒂纵向切开,10%福而马林液固定,以备免疫组化和光镜检查。
2.4免疫组化检查
2.4.1将10%福尔马林固定的肾组织块,予以酒精脱水,石蜡包埋,制成厚4μm的石蜡切片,作HE染色PAS染色及免疫组织化学染色。
2.4.2.石蜡切片脱蜡至水。
2.4.3 3%H2O2水室温孵育15钟,以清除内源性过氧化物酶的活性。
2.4.4. 蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟。
2.4.5. 采用微波炉抗原修复法,将切片放入盛有0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH 6.0)的容器中,置医用微波炉内加热,温度保持在92℃—98℃之间,持续15分钟。取出容器,室温冷却15分钟,PBS冲洗。
2.4.6. 10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭,37℃孵育20分钟。
2.4.7. 倾去血清,滴加1?80稀释的兔抗TGFβ1多克隆抗体,Ⅳ型胶原工作液,37℃孵育60min ,PBS冲洗,5分钟×3次。
2.4.8. 直接滴加二抗工作液,37℃孵育20分钟。PBS冲洗,5分钟×3次。
2.4.9. 3,3′-二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzine,DAB)显色剂显色。
2.4.10. 自来水充分冲洗,复染,封片。
3. 结果判定:采用HPIAS-1000高清晰度彩色图象分析系统7.0(同济医科大学千屏影象工程公司),进行半定量分析。
4.统计学处理:数据以均数±标准差表示,所有数据用SPSS11.5统计软件处理,组间差异比较用单因素方差分析。
结 果
1.大鼠的生存情况
实验第4天,除2只灌胃时误灌气管死亡外,其余大鼠均存活,但A组出现了明显的反应迟钝,竖毛,食量减少等表现。B、D、E组亦有上述表现,但较轻;实验第6天,A组大鼠 开始出现死亡(2只);除C组外余组均出现明显的反应迟钝,竖毛,食量减少等表现;实验第8天,A组共死亡4只,D、 E组各死亡1只,B组、C组无死亡。B、C、D、E各组与A组比较P?0.05。
2.体重、肾重、肾重/体重的变化:
从表1可知:与C组相比, A、B、D、E组,大鼠肾重增加;但B、E组无统计学差异;肾重体重比,A组明显增高,其它组增高无统计学差异。
3.尿常规的变化:
从表2可知:所有含木通组均出现了尿红细胞、白细胞、尿蛋白和尿糖,个别组出现了管型,其中以A组最严重。
4.尿量、尿蛋白和尿糖定量、尿NAG酶和尿β2-M、血肌酐和尿素氮的变化:
从表3可知:含木通各组尿量在第4天在均减少,以单纯木通组最严重,至第8天则增多。各实验组尿糖、尿蛋白定量第8天均增加。
尿NAG酶在第4天A、B、D组均轻度增高,其中A组增高最明显;第8天时,所有含木通各组的尿NAG酶均明显增高;与A组比较,B、D、E组均有降低;尿β2-M也有不同程度的增高。
含木通各组BUN、CRE第8天时均增高,其中A组差异最大,E组差异最小。
4.免疫组化肾组织TGF?1、LN、Ⅳ型胶原的变化:从表4可知:第8天时,与C组比较,各组的TGF?1、Ⅳ型胶原有不同程度的升高,有不同程度的升高;与A组比较,B、D、E组均有降低,但只E组有统计学差异。
病理变化各实验组以E组最轻,未见到,但可见肾小管上皮细胞空泡变性,其他组可见基底膜裸露现象;肾小球变化不明显。(见插图)
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