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- 人脐血干细胞对大鼠外伤性视神经病变F-VEP的影响
- 作者:江冰|发布时间:2011-06-26|浏览量:1716次
外伤性视神经病变是严重的致盲性疾病,目前的治疗方法有药物治疗、手术治疗以及药物和手术联合治疗等,但各种治疗方法的疗效差别很大。近期有学者提出采用移植干细胞治疗视神经损伤的构想,并已在动物实验中取得了一定的进展。闪光视觉诱发电位(flash visual evoked potentials,F-VEP)是一种评价视神经功能状态较为成熟、客观和有效的方法,主要反映视网膜神经节细胞( retinal ganglion cells, RGCs)到视皮层的功能状态,其波形稳定,重复性好,且无性别或眼别的差异[1],通过F-VEP检查可以发现外伤性视神经病变的严重程度,因此,利用视觉电生理学手段监控并从功能方面论证视神经损伤后修复和再生的变化是非常必要的。湘雅二医院眼科江冰
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
1.1.1 动物来源及饲养环境:所有Sprague-Dawley(SD)大鼠均由中南大学湘雅二医院动物实验中心提供,SPF级,体重约200-300g。
1.1.2 动物分组:48只大鼠按随机数字表法分成A、B、C、D四组,每组12只。所有大鼠的左眼为视神经损伤眼,右眼为正常对照眼。每组各12只。A组为视神经损伤组,B组为神经营养因子组,C组为人脐血干细胞组,D组为人脐血干细胞+神经营养因子混合组。所有大鼠分别在损伤后1h、1w、2w、3w和4w进行损伤眼和正常对照眼的F-VEP检查,记录波幅及峰潜时。
1.2 实验方法
1.2.1 大鼠外伤性视神经病变模型的制作及纳入标准:参照江冰等[2]所用的方法制作SD大鼠视神经部分损伤动物模型,大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛3.5ml/kg)后,显微镜下垂直剪开上睑皮肤、上方球结膜,暴露视神经,用夹持力为40g的特制小夹(访日学者提供)在球后2mm处夹持视神经30s。夹持后立即进行观察,若大鼠伤眼瞳孔散大,直接对光反射消失,间接对光反射存在,视网膜血管无出血或梗塞,伤后5分钟内血流完全恢复可纳入实验。
1.2.2 药物干预:治疗组在视神经部分损伤模型制作后,立即进行如下操作:用30g的注射器针头在显微镜下于颞上方的角膜缘后1mm处刺穿结膜和巩膜后即将针头退出,用微量计量器分别吸取人脐血干细胞(干细胞数目约为106个,深圳北科生物)、脑源性神经营养因子(BDNF,深圳北科生物)及混合液各10μl,在显微镜下从预先穿好的针孔处以45度进入眼内,针尖向后朝向视神经,看到针尖出现时即缓慢注入液体,注射完可见到玻璃体腔有泡状物形成。注射完针头留60s后退出。
1.2.3 F-VEP的检测方法
电生理检查参照国际临床视觉电生理标准[3]。将大鼠腹腔麻醉后固定于实验台,复方托品酰胺散瞳。将视觉电生理检查系统(重庆医用设备厂)的记录电极插入枕后隆凸皮下,参考电极置于双眼连线中点皮下,接地电极置于右耳后皮下,暗适应15min后记录F-VEP。每只动物记录稳定波形3次,每只动物检查一眼时,用自制不透光黑色眼罩完全遮盖对侧眼。先检测正常眼,后检测损伤眼。
1.2.4 观察指标
采用Harding的命名法[3]。我们的实验记录到的F-VEP波形是比较稳定的N-P-N波形,分别命名为N1、P1、N2,初始波N1、正波P1和N2波的潜伏期以毫秒(ms)为单位,N1-P1和P1-N2波幅的大小以微伏(μV)为单位。测量方法:峰潜时的测量由起始至N1的顶峰为N1的峰潜时,由起始至P1的谷底为P1的峰潜时,依此类推;振幅值的测量为N1-P1的振幅由N1的顶峰至P1的谷底为N1-P1的振幅值,依此类推。指标值计算机自动测量,各指标值是三次测量的平均值。
2. 统计学分析
用SPSS10.0统计软件包进行统计,各数据用(x±s)表示。各指标组内比较行配对t检验,组间比较用用LSD-t检验,各指标之差值行方差分析,组间有差异者再行两两比较。
3. 结果
3.1各组大鼠的F-VEP图形:所有大鼠正常对照眼的F-VEP的波形稳定(图1),随时间延长均无明显变化;其波幅波动于12.1±1.5~13.5±1.6(μV)之间;峰潜时波动于72.9±6.7~74.2±6.1(ms)之间。损伤组大鼠视神经F-VEP的波幅变低、波形变宽;视神经受损伤越重,其F-VEP的潜伏期愈长,波幅愈低,随观察时间的延长,这种改变愈明显(图2A、B和C);在相同时间点,治疗组大鼠仍可观察到F-VEP波形的存在,与损伤组相比,其波幅较窄,潜伏期稍缩短(图3、4和图5)。随观察时间的延长,这种改变更显著。
3.2 损伤组与治疗组大鼠F-VEP的P1波幅比较(表1):损伤组和治疗组大鼠的波幅随时间延长均有不同程度
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3.3 损伤组与治疗组大鼠F-VEP的P1峰潜时的比较(表2):治疗组和损伤组大鼠的峰潜时均随时间而变化。自第1w开始,各治疗组的峰潜时均较损伤组缩短;损伤后第2w,损伤组与各治疗组之间的峰潜时差异最大,以混合药物治疗组明显;在第3w时峰潜时的峰值均达到最长;第4w时各组的P1峰潜时均有缩短。损伤组与各治疗组之间的两两比较,除损伤后1h组的差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各时间点的差异均有统计学意义(1w P<0.05,2w、3w、4w P<0.01)。自第1w开始后的各个时间点,混合药物治疗组的峰潜时的峰值均较神经营养因子治疗组缩短,差异均有统计学意义(P<0.05);其余各治疗组之间在相同时间点的两两比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
4. 讨论
外伤性视神经病变(traumatic optic neuropathy,TON)是指外力通过骨质或眼球的移动传递给视神经造成的间接损伤,损伤后可以没有临床表现,却有视力的丧失[4],故在临床和实验研究中常采用客观而敏感的电生理指标来进行评价。F-VEP是研究正常状态和疾病过程中视功能状态的一种较成熟而有效的无创性方法[5],可用于评估视网膜至视皮层的传导功能,了解F-VEP中波幅的下降情况及对波峰潜伏期的判断是评价视神经损伤的一种重要手段。笔者以往的研究发现[2],用夹持力为40g的视神经夹,夹持大鼠视神经4s,即可造成视网膜神经节细胞的部分丧失,从而建立外伤性视神经病变的模型。本研究中,损伤组大鼠视神经与正常对照眼相比,损伤眼的F-VEP的波形均在损伤后1h即出现明显变化,其波幅和峰潜时在各时间点与正常对照眼相比,差异均有统计学意义。
近年来有关神经营养因子以及干细胞移植在临床治疗上的作用逐步得到重视,国内已有文献报道[6-8],将视网膜祖细胞干细胞、人胚胎神经干细胞及神经干细胞等多种干细胞移植入视网膜或眼内可治疗视神经部分损伤,但尚无脐血干细胞在外伤性视神经病变中应用的报道。脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞[9],间充质干细胞具备自我更新和增殖的能力,并能在特定因素的影响或诱导下,向各种细胞或组织分化。已有众多报道,干细胞,包括神经元前体细胞和骨髓干细胞,可以在各种中枢神经系统损伤的模型中发挥有益的作用[10-13]。Zwart等[14]的研究发现,在新生大鼠的外侧膝状体处切断视束,将含间充质细胞(从人脐血干细胞分离出)的明胶海绵片放置在损伤部位,在间充质细胞移植存在时,可以在损伤部位发现宿主的神经索的突起,并有内源性神经前体数量的增多。移植4w后,移植的间充质细胞产生了神经保护作用,并促进切断轴突的RGC再生长并移行到上丘。而Naoko等[15]的研究发现:将人脐血干细胞移植入小鼠的视网膜下,两周后,这些干细胞可分化为视网膜神经细胞。这些研究结果揭示了人脐血干细胞对视网膜和视神经退行性疾病的治疗作用,并提出了其可能机制。本研究中,在造成大鼠外伤性视神经病变模型后,治疗组大鼠玻璃体腔内及时注射BDNF、脐血干细胞或二者的混合液,可使治疗组大鼠的视神经损伤明显延迟,表现为治疗组大鼠的波幅降低较损伤组缓和,峰潜时较损伤组缩短,尤以混合药物治疗组最为明显;同时,治疗组大鼠在4w后仍可引出有意义的波形,而损伤组大鼠4w时的F-VEP已无法引出有明显有意义的波形,说明损伤组大鼠的视神经已发生不可逆的损伤,而治疗组的移植物起了关键作用。本研究组的另一研究结果从形态学方面表明了人脐血干细胞对视网膜神经节细胞的保护作用(该文章已被《中华实验眼科杂志》录用,近期发表):通过HE染色和TUNEL检测显示,治疗组大鼠正常视网膜神经节细胞数量的减少较损伤组趋势缓和,且治疗组凋亡细胞的数量较损伤组减少,在损伤后相同时间点的两两比较,两组间视网膜神经节细胞数量和TUNEL阳性细胞数量的差异均有统计学意义(P<0.01)。
本研究发现,用特定的视神经夹造成大鼠外伤性视神经病变模型,大鼠损伤眼在损伤后早期即可出现F-VEP波幅和峰潜时的异常,表明有视神经功能的下降。而神经营养因子、人脐血干细胞以及人脐血干细胞+神经营养因子的混合液在玻璃体腔的移植,可使大鼠视神经部分损伤后的F-VEP的波幅提高、峰潜时缩短,特别是神经营养因子+人脐血干细胞的混合液对视神经损伤的治疗作用最强,可能是神经营养因子在脐血干细胞的分化中发挥了作用。人脐血干细胞和神经营养因子可使损伤的视神经的功能有不同程度的恢复,从功能学方面证明了脐血干细胞在治疗外伤性视神经损伤中有明确的疗效,为临床治疗外伤性视神经病变提供了新的思路。
参 考 文 献
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