肿瘤干细胞的理论基础_专家库

邓艳红副主任医师 医院：中山大学附属第六医院科室：肿瘤内科

肿瘤干细胞的理论基础

具有独特的自我更新和产生后代分化细胞能力的细胞被称之为干细胞。最原始的干细胞是胚胎干细胞，从胚泡的内层细胞来源。这种细胞有多能性并最终形成人体的各种组织。过去50年在造血干细胞方面的研究基础上发现很多其他的成人组织也含有干细胞。这些成人组织内的干细胞维持动态的自我更新能力，也能在组织损伤的时候迅速启动修复组织。干细胞生物学的时代已经来临，其定义为具有永久的自我更新和通过分化产生组织特异性成熟细胞的能力，大多数组织中的干细胞稀少^[４]。不可置否的证据说明造血系统存在干细胞为分离几种组织特异性干细胞和祖细胞开启了大门。虽然理论上每种特殊的组织均由组织特异性干细胞分化形成，只在少数几种组织中成功鉴定和分离了干细胞，如造血组织^[５]、肺^[６]、皮肤^[７]、肠道^[８]，更新慢的组织中如心脏和中枢神经系统也发现了干细胞的存在^［４］。组织动态平衡的压力决定干细胞根据不同的需要进行对称分裂产生2个子代祖细胞，或者两个干细胞。更重要的是干细胞还具有不对称分裂的能力，产生的2个子代细胞一个干细胞，另一个是能继续分化但是没有自我更新能力的祖细胞。造血干细胞（HSCs）在鼠和人中均成功分离^{[9，10，11，12]}，能重建血液和免疫系统，造血干细胞早已广泛的运用到治疗当中^[13]。干细胞生物学中最重要的一环就是明确干细胞自我更新的机制，自我更新能力对维持干细胞功能至关重要，因为这种能力是需要维持一个生物体终生的。然而，不同组织的干细胞有不同的发展潜能，依据组织对自我更新和分化的要求不同而不同。造血干细胞占小鼠骨髓细胞的0.05%，根据自我更新能力的不同可分为长期自我更新HSCs，短期自我更新HSCs和没有自我更新能力的多能祖细胞，这些细胞群形成线形关系，长期HSCs生成短期HSCs，后者再生成多能祖细胞^[14，15]。当长期干细胞离开干细胞库形成多能祖细胞的过程中逐渐失去自我更新的能力而变得分裂活跃。长期干细胞在小鼠一生不断生成成熟的细胞，短期干细胞和多能祖细胞能在8个星期内重组接受了致死性放射小鼠的血液系统。尽管对造血干细胞的研究越来越深入，但是基本的问题自我更新能力是如何调节的仍然是未知数。大多数情况下，联合多种生长因子能在体外扩增造血干细胞，但却在长期的培养中无法阻止其分化。尽管已经有改善，仍然很难在体外扩增能移植的造血干细胞。在接受致死性放射的小鼠中重建骨髓的试验开展了半个多世纪，这个试验证明了造血干细胞的存在^[16，17]。尽管这群细胞的特性还没有完全清楚，但是它的发现拓开了干细胞生物学的领域。中山大学附属第六医院肿瘤综合治疗科邓艳红

几乎在造血干细胞被发现的同时，有观察显示肿瘤细胞在体内和体外的自我更新能力存在异质性。1973年，Ernest McCuloh和他的同事们发现只有1/100-1/10，000的鼠骨髓瘤细胞能在体外形成集落。1963年Robert Bruce和他的同事们发现只有1-4%的移植的鼠淋巴瘤细胞能在受体动物的脾脏形成集落^[18，19]。1985年Jim Griffin等发现急性髓性白血病细胞在甲基纤维素形成集落能力低下^[20，21]。在实体瘤中也得到类似的结果。Anne Hamburger和Sydney Salmon发现1/1，000-1/5，000实体瘤细胞如肺癌、卵巢癌及脑肿瘤能形成集落^[22]。另外1961年Chester Southam和Alexander Brunschwig发现从病人分离出来的肿瘤细胞种植到同一个病人的皮下肿瘤形成能力低下，只有超过1，000，000细胞才能启动肿瘤的形成（当然这个试验不符合现在的伦理要求）^[23]。这些现象均说明和白血病干细胞的理论一样，只有少量的癌细胞能引起肿瘤的发生，这些引起肿瘤发生的细胞被称之为肿瘤干细胞^[22]。　　　

肿瘤干细胞的假设源于150多年前病理学家Rudolph Virchow和Jµlius Cohnheim提出的肿瘤的发生源于成熟体内剩余的冬眠胚胎组织^[24，25]。这种假设源于胎儿的发育与某种肿瘤的组织学相似性如恶性畸胎瘤^[24]，以及两者均有无限增生和分化的能力，虽然不同的是肿瘤组织分化能力障碍。肾巢（不正常的胚胎肾脏前体细胞巢状分布）导致Wilm"s瘤，在孕期就可通过超声检测到^[25]。出生时能检测某些与儿童白血病相关的突变，包括体突变TEL-AML1^[27]，MLL-AF4^[28]，AML-ETO^［29］和OTT-MAL移位。Van R. Pottter和Barry Pierce 在1970s和1980s更新这个概念，把肿瘤定义为成熟障碍的干细胞^[30，31]。肿瘤由一群异质性的细胞组成，里面有一小群细胞专门负责肿瘤的生长和传代。另一种假设是随机的模型也能解释肿瘤抑制性自我更新的潜能。这种模型认为所有的肿瘤细胞都有能力自我更新和重建肿瘤，但是任何一个细胞在适当的环境下进入细胞周期导致肿瘤发生的概率低下^[32]。要区分两种理论模型必须根据免疫表型或者功能特性来纯化同质性的细胞进行长期的功能分析。功能评估不仅要评估肿瘤干细胞形成新肿瘤的能力，而且能重新形成与原代肿瘤完全一样表型的子代肿瘤。因为体外实验适于血液系统研究，1980s末和1990s，抗体技术的发展让Irving Weissman及其同事基于表型阐明了这个系统的个体发生学^[33]，这些研究发现了血液系统各系的表型标记物并阐明了造血细胞发育过程，同样地，可应用到恶性血液系统疾病的个体发生学。另外一个大力促进白血病和其他肿瘤干细胞研究的技术是高速多参数的流式细胞仪，根据荧光标记的抗体识别细胞表面的抗原来确认和分离不同的细胞群。通过激光的激发，荧光标记的抗体能产生特殊的波长，从而检测并计算表达相应抗原的细胞群。另外，通过电压的分离带正电的荧光复合物，使表达抗原的细胞能被收集和进一步分析^[34，35]。基于现代技术的细胞亚群的功能和免疫表型的分析，肿瘤被广泛的认为是一种干细胞失常的疾病，肿瘤的发生和生长源于少部分有自我更新能力的肿瘤干细胞。正常干细胞和肿瘤干细胞均在血液系统肿瘤中先被发现的。恶性血液病的发生是目前研究得最透彻的，也是最方便进行实验和临床研究地，对白血病干细胞生物学的研究能为其他肿瘤干细胞的研究提供范例。另外，更好的明白正常和肿瘤干细胞之间的关系能允许我们利用自我更新的程序进行某些组织的再生而不会导致肿瘤的发生，并通过干扰肿瘤干细胞的自我更新来治疗肿瘤。John Dick等是利用严重免疫缺陷鼠（SCID）和非肥胖糖尿免疫缺陷鼠（NON/SCID）异体移植干细胞分析系统的先锋。他们发现正常的人干细胞和未分离的白血病细胞能在SCID鼠上生长，这些细胞的后代可通过流式细胞仪检测出来。另外，在小鼠体内所有成熟的细胞系，除了T细胞都是正常干细胞生成的，而白血病细胞在小鼠体内重构了人白血病。研究者命名这些在受体小鼠中诱导血液系统发育的细胞为“SCID重建细胞”或“SCID白血病启动细胞（SL-IC）”^[35]。然而，SCID小鼠分析系统的局限性在于不能明确SL-IC的表型，及无法测试这群细胞长期自我更新的能力，这个系统里需要大细胞培养液来保证移植的成功，系列性移植受体小鼠来检测长期自我更新能力是不可能的。NON/SCID白血病模型的出现弥补了这些缺陷并允许让亚细胞的分离和序列性移植成为可能。John Dick等从7个代表7类不同AML亚型中分离CD34+CD38+和CD34+CD38-细胞亚群。将两群细胞静脉输入亚致死剂量放射接受人细胞生长因子治疗的NON/SCID鼠中，4-8周后根据人特异性DNA序列评估移植物，再从小鼠骨髓分离人的细胞根据CD45的表达，并植入第二个受体，这些实验表明能移植人AML的细胞是CD34+CD38-的亚群^[37]。另外这些细胞能诱发产生不同亚型的AML，在第二代受体鼠内的白血病仍然与人白血病一致，说明白血病干细胞有长期自我更新的能力。基于这些发现，作者提出AML与正常的血液系统类似是分级组成的。这个模型认为白血病干细胞负责自我更新和产生克隆性能增殖但不能自我更新的祖细胞。且基于结构和表型的相似性，白血病干细胞很可能由造血干细胞转化而来。类似的工作在携带BCR-ABL融合基因的急性淋巴细胞白血病，启动细胞的表型为CD34+CD38-。B细胞前体淋巴细胞白血病的启动细胞表型为CD34+CD10-CD19。另一个与融合基因BCR-ABL相关的肿瘤是CML，也是个干细胞疾病，BCR-ABL基因的转录子在造血各系细胞包括CD34+的细胞中见到^[38]。这些数据都与正常造血干细胞维持血液系统等级相似，更加说明造血干细胞可能是癌变细胞的始变者。然而，没有自我更新能力定型的祖细胞也能在恶性转化的过程中通过激活癌基因的途径重新获得自我更新的能力^[39]。有实验表明没有自我更新的祖细胞通过流式细胞仪纯化并转入MLL-ENL或MOZ-TIF2癌基因能在体外重新获得自我更新能力，包括在没有实质性细胞支持的甲基纤维素的培养基中长期形成克隆及在液体培养基中生长的能力，MLL是一个涉及染色体重建的组蛋白甲基转移酶^[40]，MOZ和TIF2都是转共激活子^[41]。这些转导的细胞还能在移植的小鼠中形成AML并传递给下一代小鼠。这并不是因为插入的突变引起，因为单纯转导MOZ-TIF2并不能诱发这些表型的出现^[39，42]，也并不是所有的癌基因都能逆转细胞的自我更新能力，转导BCR-ABL就不能改变定型的祖细胞^[39]。因此也有相当一部分证据说明定型的祖细胞是肿瘤发生时形成肿瘤干细胞的转化细胞。干细胞自我更新的调节机制还不清楚^[３２]。至少在正常干细胞和肿瘤干细胞之间有相当部分是重叠的。分子调控自我更新的基因和通路包括Bmil的产物和其他的多梳状基因^[43]，Wnt-β-catenin信号通路^[44,45]，Notch^[46]和 SHH^[47]及HOX家族转录因子^[48]。肿瘤干细胞像正常干细胞一样维持肿瘤细胞的生长和播散。某些肿瘤的异质性产生有可能是因为在不同的环境和持续突变造成^［32］。1994年Dick等及其同事在急性髓性白血病的患者中分离出假定的肿瘤干细胞^[37]，这是第一个被识别分离的肿瘤干细胞，此后引发了一系列肿瘤干细胞的识别，包括急性淋巴细胞白血病^[49]，慢性粒细胞白血病^[49]，多发性骨髓瘤^[50]，结肠癌^[51,52]，乳腺癌^[53]，脑肿瘤^[54]，头颈部肿瘤^[55]，肺癌^[56]，胰腺癌^[57]，黑色素瘤^[58]，肾肿瘤^[59]和肝癌^[60]。