慢性前列腺炎患者前列腺液的微生物研究

【摘要】：目的 探讨慢性前列腺炎患者前列腺内的微生物种类。方法 慢性前列腺炎81例，其中Ⅱ型前列腺炎（慢性细菌性前列腺炎）11例，Ⅲ型前列腺炎（慢性非细菌性前列腺炎）70例。前列腺液取材行细菌培养、解脲脲原体（UU）和人型支原体(MH)的培养、沙眼衣原体（CT）检测，并行淋病奈瑟菌(NG)、结核分枝杆菌(TB)、UU、CT、HPV、HSV-2、CMV的PCR检测，以及细菌16S rDNA检测。结果 Ⅱ型前列腺炎的病原谱涵盖多种革兰阳性菌和革兰阴性菌，还有CT、CMV、HSV-2和HPV。Ⅲ型前列腺炎中解脲支原体阳性率 37.0%（30/81），沙眼衣原体阳性率13.6%（11/81）。前列腺液病毒感染率分别为HPV 8.6%（7/81），HSV-2 11.1%（9/81），CMV 18.5%（15/81）。研究组前列腺液细菌16S rDNA阳性率为66.7%，其中Ⅱ型前列腺炎100%，Ⅲ型前列腺炎61.4%。结论 慢性前列腺炎患者前列腺内微生物种类繁多，其中许多微生物可能是Ⅲ型前列腺炎的致病因素。浙江省人民医院泌尿外科任黎刚

【关键词】 慢性前列腺炎；微生物；微生态
【中图分类号】R378；R697+.33  【文献标识码】 A
Investigation of microorganisms in expressed prostatic secretion(EPS) from chronic prostatitis
REN Li-gang (Zhejiang Provincial Hospital, Hangzhou 310014, China)
【Abastract】Objective To investigate the microorganisms in the prostate of patients with chronic prostatitis. Methods Eighty-one patients with chronic prostatitis were included in the study, among which 11 cases were classified into type Ⅱ, 70 cases were classified into type Ⅲ. EPS samples obtained from patients were subjected to urological evaluation including routine microscopic examination of EPS, bacteria culture, mycoplasma culture and chlamydiosis culture. Arbitary PCR were performed to confirm Neisseria gonorrhoeae, Mycobecterium Tuberculosis, Mycoplasma, Chlamydiosis, viruses including HPV, HSV-2 and CMV; and universal primers PCR was carried out to detect 16S rDNA of bacteria. Results Many microbes were found in prostatitis of type Ⅱ, including gram-negative bacillus, gram-positive bacillus, CT, CMV, HSV-2 and HPV. Among chronic type Ⅲ prostatitis, UU positive rate was 37.0% (30/81), and CT positive rate 13.6%(11/81). Infection rate of the HPV was 8.6%(7/81), HSV-2 11.1%(9/81), CMV 18.5%(15/81). Total positive rate of bacteria 16S rDNA in samples was 66.7%, and type Ⅲ prostatitis shows 61.4%. Conclusions Our results indicate that various microorganisms exist in the prostate of patient with chronic prostatitis. In addition, many pathogens may be included in pathologic process of the type Ⅲ prostatitis.
【Key words】chronic prostatitis; micro-organism; Microecology

慢性前列腺炎病因较为复杂，病原微生物是最为重要的病因之一。为了探明慢性前列腺炎患者前列腺内的微生物种类，我们采用传统和现代微生物学方法对前列腺液的多种微生物进行调查研究，现报告如下。
1材料和方法
1.1 临床资料  2005年1月~2007年12月在我院就诊的符合入选条件的81例慢性前列腺炎患者，按照美国国立卫生研究院慢性前列腺炎症状指数(NIH?CPSI)中的症状评分≥10分，慢性前列腺炎症状持续3个月以上，前列腺液卵磷脂小体减少或消失，排除尿道炎和膀胱炎。其中Ⅱ型前列腺炎（慢性细菌性前列腺炎）11例，年龄24～41岁，平均年龄30．5岁，病程6个月～3年；Ⅲ型前列腺炎（慢性非细菌性前列腺炎）70例，其中ⅢA型（炎症性慢性骨盆痛综合征）36例，年龄20～52岁，平均年龄31.2岁，病程3个月～5年；ⅢB型（非炎症性慢性骨盆痛综合征）34例，年龄20～51岁，平均年龄32.2岁，病程3个月～8年。
1.2 病原学检测  75%酒精消毒尿道外口，中段尿化验排除尿道炎和膀胱炎。在无菌条件下取尿道分泌物拭子和前列腺按摩液，并送细菌培养、解脲脲原体（UU）和人型支原体(MH)的培养、沙眼衣原体（CT）快速胶体金法检测。另留一份标本行淋球菌（NG）、结核杆菌（TB）、解脲支原体（UU）、沙眼衣原体（CT）、人类乳头瘤状病毒（HPV）、疱疹Ⅱ型病毒（HSV-2）、巨细胞病毒（CMV）的特异性PCR检测，以及细菌16S rDNA检测。特异性PCR按照常规技术方法进行；PCR扩增细菌16S rDNA试剂盒购自Takara宝生物（大连）有限公司，PCR具体操作如下：取前列腺液50μl，用热裂解法提取样本中的细菌DNA（提取试剂由无锡市克隆技术研究所提供），于20μl TE中。取此TE液5μl为16s rDNA扩增模板。取PCR反应混合液25μl，正向引物0.5μl，反向引物0.5μl，加无16s rDNA水至45μl，加入模板DNA5μl使最终反应体系为50μl，同时做阴、阳对照，在PE 9700扩增仪（美国ABI公司）扩增，扩增条件94℃ 5min，（94℃ 1min，55℃ 1min,72℃ 1.5min）循环30次，72℃延伸5min，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴乙啶染色，340nm 紫外线透射，于500bp 处与阳性对照同时出现条带的样本为阳性。
1.6 统计学方法：所有数据采用SPSS 10.0版本软件在计算机上进行统计学处理。率的检验采用x2检验，P< 0.05被认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1  病原学结果 
在11例Ⅱ型前列腺炎中，致病菌病原谱如下：溶血性葡萄球菌4株，表皮葡萄球菌4株，耳葡萄球菌1株，粪肠球菌1株，阴道加德纳菌1株，大肠埃希菌1株，肺炎链球菌1株。其中混合感染表皮葡萄球菌和粪肠球菌1例；溶血性葡萄球菌和耳葡萄球菌1例。
ⅢA型前列腺炎中，培养法检测发现解脲支原体14株，其中1例伴人型支原体感染，而PCR法检测阳性9例，阳性患者计18例，感染率为50.0%(18/36)。快速胶体金法衣原体检测CT阳性1例，PCR法阳性6例，阳性患者计6例，感染率为16.7%(6/36)（表1）。
ⅢB型前列腺炎中，培养法检测发现解脲支原体10株，而PCR法检测阳性9例，阳性患者计12例，感染率为35.3%(12/34)。快速胶体金法衣原体检测CT阳性0例，PCR法阳性5例，阳性患者计5例，感染率为14.7%(5/34) （表1）。
2.2 在各型前列腺炎中HSV、HPV、CMV均有发现，各型前列腺炎中的阳性率差异无统计学意义。其中CMV阳性率18.5%（15/81），HSV-2 11.1%（9/81），HPV 8.6%（7/81）。
2.3通过16s rDNA检测发现，在所有前列腺炎患者中的阳性率66.7%（54/81），Ⅱ型、ⅢA型、ⅢB型阳性率分别为：100%（11/11）,63.9%（23/36）、58.8%（20/34）。Ⅱ型与ⅢA型、ⅢB型比较，阳性率差异有统计学意义（P<0.05）；ⅢA型与ⅢB型相比，阳性率差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 前列腺炎前列腺液标本的病原学检测结果
分型 例数 UU CT NG TB HSV HPV CMV 16s rDNA
Ⅱ 11 0 1 0 0 3 1 2 11
ⅢA 36 18 6 1 0 4 3 8 23
ⅢB 34 12 5 0 0 2 3 5 20
总计 81 30 12 1 0 9 7 15 54

3  讨论
慢性前列腺炎疗效差的原因复杂，感染性、神经性、内分泌性和心理性因素均可能参与盆腔疼痛等症状的发生，但最令人困惑的是致病菌的复杂性。Lobel等[1]将与前列腺炎症有关的尿路病原菌概括为5大类。目前认为前列腺炎是一种或多种病原体的感染性疾病，该点上对于慢性细菌性前列腺炎的病因没有太多的争议，但对于Ⅲ型前列腺炎（过去称为非细菌性前列腺炎）尚缺乏统一的认识，事实上这一类前列腺炎却包括了大多数的患者。
由于细菌培养鉴定的局限性，有相当一部分致病微生物所致的慢性前列腺炎无法甄别出来，我们应用PCR技术深入研究前列腺液中的微生物，试图了解其前列腺内的微生物。基于专一性引物的特异性PCR和基于细菌16s rDNA的通用PCR两者的结合综合了两种方法的优势，更加全面地对前列腺内的可能致病微生物作病原谱的调查。我们发现前列腺内的病原体分布是广泛的，覆盖多种类的微生物，除了致病菌，其中不乏许多“正常菌群”。在调查中发现UU的感染率达到37.5%（30/80），远高于正常人群的报道。Mandar等[2]认为生殖支原体和微小脲原体是重要的病原体，Ⅲ型前列腺炎中感染率达到18%左右。已往关于前列腺液中病毒感染的专门研究报道不多，除了一组报道[3]HSV-Ⅱ阳性率为16．2%的研究外，仅有一些个例报道。我们发现多种病毒的感染，阳性率分别为：HSV 11.1%，HPV 8.6%，CMV 18.5%。对于病毒的真正意义，尚没有科学的对照研究说明。遗憾的是，本研究未做厌氧菌和真菌分离培养，有研究报道慢性前列腺炎前列腺液标本中假丝酵母菌阳性率占11.7%[4]；厌氧菌在前列腺炎阳性率高达36%[5]。
16s rDNA检测发现，在所有前列腺炎患者中的阳性率达到66.7%。16s rDNA检测阳性有三方面含义，第一提示现症感染；第二提示曾经有病原体侵入前列腺内，感染之后的细菌残骸持续存在导致了临床症状；第三揭示正常菌群，可能这些菌群构成了前列腺和尿道的本身的“微生态”。通过16s rDNA检测，可以认为在Ⅲ型前列腺炎中有许多未能发现的细菌或细菌残骸的存在，无论它们的致病力如何。
已有研究证明，前列腺腺管附壁细菌、结石和腺管堵塞等因素，可能导致前列腺液内微生物检测结果的片面性。比如存在“生物膜”黏附到前列腺导管壁或者存在于梗阻的导管内，导致细菌无法检测到[6]。近来发现与引起肾盂肾炎和膀胱炎的细菌比较，导致前列腺炎的致病菌产生更多的溶血毒素，并且明显易于形成生物膜[7]。
本研究的结果提示前列腺内有一个特殊的微生物群落，前列腺炎的致病微生物种类繁多，甚至Ⅲ型前列腺炎的发病过程中也可能有微生物的参与。推测前列腺炎发生过程为；尿道感染波及前列腺后，在尿液返流的协同下，发生特异性或非特异性炎症反应，并导致神经病变等，引起一系列的临床表现。由于我们的病原学研究涵盖面有限，未涉及健康人群的调查，因此需要进一步的扩大研究对象并作DNA测序工作，更加深入地揭示前列腺内的微生物。

参考文献
[1] Lobel B，Rodriguez A．Chronic prostatitis：what we know，what we do not know，and what we should do! World J Urol，2003，21(2)：57-63．
[2] Mandar R，Raukas E，Turk S，et al．Mycoplasmas in semen of chronic prostatitis patients．Scand J Urol Nephrol，2005，39(6)：479-482．
[3] 邹强，吕火祥，许立．多聚酶链反应对病毒性前列腺炎的检测研究．中华泌尿外科杂志，1998，19：107-109．
[4] 张家敏，张小贤，于志坚. 慢性前列腺炎患者假丝酵母茵感染及耐药性分析，中国微生态学杂志，2005.17（4）：302-303.
[5] 刘元晓，董德欣，莫成锦. 慢性前列腺炎患者前列腺液厌氧菌的检测及分析，现代泌尿外科杂志，2002，7(3)：166.
[6] Nickel JC, Bacterial biofilms in urology. Infect Urol 1998;11:169-175
 [7] Soto SM，Smithson A，Martinez JA，et al．Biofilm formation in uropathogenic Escherichia coli strains: relationship with prostatitis, urovirulence factors and antimicrobial resistance．J Urol，2007，177(1)：365-368.