刘久华主任医师 医院：连云港市第二人民医院科室：泌尿外科

COX-2和VEGF在前列腺癌中的表达及其与肿瘤血管生成关系的研究

刘久华张炜

（南京医科大学第一附属医院泌尿外科，江苏南京 210029）

【摘要】目的探讨环氧化酶-2（COX-2）和血管内皮生长因子（VEGF）在前列腺癌(PCa)中的表达及其与肿瘤血管生成的关系。方法 30例前列腺癌组织，按Gleason评分，将≥7分者列为高Gleason评分组（n=10）；<7分者列为低Gleason评分组（n=20）。良性前列腺增生（ BPH）20例，BPH并高级前列腺上皮内瘤(PIN)12例。正常前列腺组织(NP)10例。应用免疫组化方法检测各组织中COX-2、VEGF的表达水平及其微血管密度(MVD)。结果 PCa、PIN中COX-2、VEGF的阳性表达率及MVD值高于BPH及 NP（p均<0.05）, 高Gleason评分组中COX-2、VEGF的阳性表达率（81.3%、93.8%）及MVD值(63.4±1.80)高于低Gleason评分组(42.9%、64.3%、51.7±1.56,p均<0.05）。 COX-2与VEGF之间呈正相关（r=0.630,p<0.05），COX-2阳性组及VEGF阳性组MVD值（69.3±3.91、72.6±3.63）均高于COX-2阴性组及VEGF阴性组（43.9±2.51、40.6±2.84,p均<0.05）。结论 COX-2、VEGF在前列腺癌中均为高表达，且与肿瘤的Gleason评分密切相关，COX-2与VEGF的表达可能有协同作用，共同促进肿瘤血管生成，增加微血管密度。连云港市第二人民医院泌尿外科刘久华

【关键词】前列腺肿瘤；环氧化酶-2；血管内皮生成因子；微血管密度【中图分类号】：R737.25 【文献标识码】：A

Expression of cox-2 and VEGF in human prostate cancer and the relationships between them and tumor angiogenesis

LIU Jiu-hua ZHANG Wei

Department of Urology, First Affiliated Hospital, Nanjing Medical University , Nanjing 210029, China

【Abstract】 Objective: To investigate the expression of Cycloxygenase-2(COX-2),vascular endothelial growth factor(VEGF) in human prostate cancer(PCa) to explore the relationships between them and tumor angiogenesis in PCa. Methods :Specimens from 72 patients with PCa(30 cases),benign prostatic hyperplasia (BPH,20 cases), high-grade prostate intraepithelial neoplasia (PIN,12) and normal prostate (NP,10 cases) were comprised in the study . the PCa was divided into high Gleason score group (Gleason score≥7) and low Gleason score group (Gleason score<7). The expression of COX-2 ,VEGF and the microvessel density(MVD) were detected by immunohistochemistry. Results: The positive rates of COX-2 ,VEGF and MVD in PCa and PIN were higher than those in BPH and NP(all p<0.05), the positive rates of COX-2 and VEGF and MVD were higher in high Gleason score group than those in low Gleason score group(all p<0.05). there was statistically significant positive correlation between expression of COX-2 and VEGF(r=0.630,p<0.05),the MVD values in COX-2 positive(69.3±3.91) and VEGF positive(72.6±3.63) groups was significantly higher than those in COX-2 negative and VEGF negative groups (43.9±2.51、40.6±2.84 all p<0.05). conclusion The high expressions of COX-2 ,VEGF in PCa may be related to tumor pathological grade.COX-2 may modulate up- expressions of VEGF, promote angiogenesis and increase MVD in tumer.

【Key Words】 prostate neoplasm; Cycloxygenase-2; vascular endothelial growth factor; microvessel density

环氧化酶-2（COX-2）是花生四烯酸转化成前列腺素过程中的重要限速酶。近年来研究表明其在多种肿瘤组织中表达增强，并认为其与肿瘤血管的生成、肿瘤的发生、浸润和转移密切相关，是肿瘤防治的新靶点。血管内皮生长因子（VEGF）是重要的血管生成因子之一，在肿瘤血管生成中起重要的作用。本研究通过免疫组化方法检测正常前列腺 (NP)、良性前列腺增生（ BPH）、高级前列腺上皮内瘤(PIN)及前列腺癌（PCa）组织中微血管密度(MVD)以及COX-2、VEGF的表达状况，探讨它们的表达与前列腺癌Gleason评分及肿瘤血管生成之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收取我院2003年1月至2005年12月收治的6 2例患者前列腺组织石蜡保存标本。其中，病理证实为BPH 20例，年龄56∽93岁，平均70岁；BPH并PIN 12例年龄62∽87岁，平均72岁；PCa 30 例，年龄57∽91岁，平均70岁，经Gleason评分，≥7分者10例，列为高Gleason评分组，<7分者20例，列为低Gleason评分组。所有患者术前均未接受过放化疗及内分泌治疗。并取正常前列腺组织10例（脑死亡患者）作对照。

1.2 试剂 COX-2兔抗人单克隆抗体，VEGF鼠抗人单克隆抗体，CD34鼠抗人单

克隆抗体,SP免疫组化试剂盒，均为即用型，均购自福州迈新公司。

1.3实验方法采用过氧化氢标记的链酶素抗生物素蛋白-过氧化物酶法（SP法）。石蜡包埋组织后4µm连续切片，常规脱蜡水化，PBS冲洗3×3min；置10mmol柠檬酸缓冲液（PH6.0）,高温高压修复抗原，冷却至室温，蒸溜水、PBS各冲洗2次，每次3 min；每张切片滴加50µl第一抗体，4ºC孵育过夜；PBS冲洗3×5min后甩去PBS液，每张切片滴加50µl生物素标记的第二抗体，室温下孵育10 min；PBS冲洗3×3min后甩去PBS液，联苯二胺（DAB）显色，苏木素复染，脱水，透明，封片。PBS代替一抗作为阴性对照，阳性对照片购自迈新公司。

1.4 结果判定细胞浆染色为棕黄色或深棕黄色为COX-2、VEGF阳性表达细胞。COX-2、VEGF免疫组化评分标准按Rahman等^[1]方法，染色范围（阳性细胞比率）分0∽4级，阴性为0；阳性细胞1%∽25%为1；阳性细胞26%∽50%为2；阳性细胞51%∽75%为3；阳性细胞76%∽100%为4。染色强度分为0∽3级，阴性为0；弱阳性为1；中等强度为2；强阳性为3。两者相加为积分。将积分〈2者定为阴性。≥2者定为阳性。CD34标记的微血管密度(MVD)计数按Weider推荐方法。先在低倍镜（×100）下扫视整个组织切片,在肿瘤浸润区域选取染色清晰、背景对比良好、微血管密度最高的视野，然后在高倍镜（×200）下观察，在肿瘤区内凡染成棕黄色的单个内皮细胞和内皮细胞簇为一个血管计数，计数4个视野中的微血管数目，取平均数为该例的MVD值。

1.5 统计学处理 MVD值以 ±s表示，应用SPSS 10.0统计软件进行四格表确切概率法、t检验及spearman等级相关分析，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组组织中COX-2、VEGF表达情况 COX-2主要表达于肿瘤细胞的细胞质，尤其是靠近核膜处，呈棕黄色或深棕黄色颗粒状（见图1）。VEGF主要表达于肿瘤细胞的细胞质，呈弥漫性分布，镜下表现酷似COX-2的表达（见图2）。各组阳性表达率见表1。PCa及PIN中COX-2阳性表达率分别为19(63.3%)和5(41.7%)，NP及BPH中COX-2阳性表达率分别为0和 1(5%)。PCa及PIN与NP及BPH相比，差异有统计学意义（p均<0.05）。PCa及PIN中VEGF阳性表达率分别为24(80.0%)和7(58.3%)，NP及BPH中VEGF阳性表达率分别为1(10.0%)和4(20.0%)，PCa及PIN与NP及BPH相比，差异有统计学意义（p均<0.05）。

图1 PCa中COX-2表达（×200）图2 PCa中VEGF表达（×200）图3 PCa 中CD34表达（×200）

表1 NP、BPH、PIN、PCa及PCa的不同Gleason评分组中的COX-2、VEGF阳性表达率[n(%)]及MVD值（ ±s）

Group n Cox-2 VEGF MVD

NP 10 0 1(10.0%) 14.1±2.20

BPH 20 1(5%) 4(20.0%) 24.3±1.45

PIN 12 5(41.7%)^* 7(58.3%)^* 48.1±3.62^*

Pca 30 19(63.3%)^* 24(80.0%)^* 56.6±3.27^*

low Gleason score 14 6(42.9%) 9(64.3%) 51.7±1.56

high Gleason score 16 13(81.3%)^** 15(93.8%)^** 63.4±1.80^**

*与NP和BPH相比，p均<0.05； **与低Gleason评分组相比，p<0.05

表2 PCa中COX-2、VEGF表达的关系

VEGF

COX-2

合计

+ -

合计

19 5 24

0 6 6

19 11 30

r=0.630,p<0.05

表3 PCa中COX-2表达与MVD的关系表4 PCa中VEGF表达与MVD的关系

COX-2 n MVD

VEGF n MVD

+ 19 69.3±3.91

- 11 43.9±2.51

+ 24 72.6±3.63

- 6 40.6±2.84

P<0.05 P<0.05

2．2各组组织中MVD检测结果血管内皮细胞标记物CD34在肿瘤组织血管内皮细胞染色程度均匀一致，呈棕黄色。PCa及PIN组织中的MVD值为56.6±3.27和48.1±3.62，明显高于BPH（ 24.3±1.45）及NP（14.1±2.20 ），差异有统计学意义（p均<0.05）。

2．3 不同Gleason评分组COX-2、VEGF表达情况及其MVD值高Gleason评分组中COX-2、VEGF的阳性表达率及MVD值为13(81.3%)、15(93.8%)和63.4±1.80，低Gleason评分组6(42.9%)、9（64.3%)和51.7±1.56。两组相比差异有统计学意义（p均<0.05）。

2，4 COX-2、VEGF及MVD各指标之间的关系对COX-2 和 VEGF在PCa中的表达水平进行相关分析,见表2，结果显示，г=0.630,p<0.05,呈正相关。COX-2 和 VEGF阳性表达组及阴性表达组的MVD值分别为（69.3±3.91 ）Vs（43.9±2.51）和（72.6±3.63 ）Vs（40.6±2.84），见表3、表4，差异具有显著性（t=25.4、18.6,p均<0.05）。

3 讨论

3．1 COX-2、VEGF在PCa中的表达情况

COX可将花生四烯酸(AA)代谢成各种前列腺素类产物,从而维持机体的各种生理病理过程。COX存在两种同功酶,即COX-1和COX-2, 正常生理状况下，COX-2在多数组织中无明显表达。近年来大量研究表明，COX-2的过度表达与PCa的发生发展密切相关^[2]。COX-2 在肿瘤发生、发展中的作用机制可能为：① 促进PCa血管生成；②促进肿瘤细胞增生、抑制细胞凋亡；③COX-2的催化产物PGE2和组胺，通过cAMP介导，使机体对细胞的免疫监视功能下降，细胞杀伤能力降低，使肿瘤细胞逃避免疫；④促进PCa的浸润和转移^[3]。COX-2通过降低介导细胞间粘附的E-钙蛋白活性、上调肿瘤细胞基质金属蛋白酶（MMP）、催化形成促血小板凝聚的血栓烷以及尿激酶型纤溶酶原激活酶（uPA）的表达上调,发挥促进转移的作用； COX-2还可通过直接导致肿瘤细胞表型改变而促进肿瘤细胞转移^[4]。研究证明，COX-2抑制剂可降低肿瘤的发生率并预防肿瘤的形成^{[5、6、7、8]}，从而从另一方面说明，COX-2在肿瘤发生发展中的作用。本研究结果显示，COX-2在PCa中的阳性表达率明显高于前列腺增生和正常前列腺组织，说明COX-2可能是PCa发生的一个重要因素。本研究还发现，COX-2与Gleason评分密切相关，高Gleason评分组中COX-2的阳性表达率明显高于低Gleason评分组，p<0.05，而Gleason评分与PCa的恶性程度及预后密切相关，评分愈高，恶性程度及预后愈差，从而提示 COX-2可作为反映PCa生物学行为的一个重要指标。

VEGF是目前已知的作用最强的促血管生成因子之一，对肿瘤血管生成及血管通透性增加有重要的调节作用^[9]。肿瘤的血管生成不仅为肿瘤细胞的生长提供了必需的营养，还可为肿瘤细胞进入循环细统导致远处转移提供通道。因此，VEGF和MVD的检测可反应肿瘤的生长和转移能力。本研究结果表明， PCa中VEGF的阳性表达率及MVD值明显高于前列腺增生和正常前列腺组织，高Gleason评分组高于低Gleason评分组。提示VEGF是PCa发生发展的另一个重要因素。

PIN是一种公认的PCa癌前病变，随访10年以上，大多数PIN将发展为PCa^[10]本研究结果显示，PIN中的COX-2、VEGF的阳性表答率均明显高于前列腺增生和正常前列腺组织，差异有统计学意义（p<0.05）。虽低于PCa，但差异无统计学意义，进一步说明COX-2、VEGF参与PCa的发生，在PCa发生过程中起重要作用，其高表达是PCa形成的早期事件。

3．2 COX-2、VEGF在PCa血管生成中的作用

在PCa发生发展过程中，血管生成是肿瘤生长和转移的关键步骤，MVD是影响肿瘤预后的重要因素。COX-2催化花生四烯酸生成的PGE2,可诱导生成VEGF。VEGF作用于内皮细胞表面的受体，进而促进血管生成。同时VEGF 又可上调COX-2的表达，从而形成一个正反馈网络^[11] 。Majima等^[12] 研究发现PGE2、PEF2增加的同时，VEGF mRNA的合成也增加，VEGF以旁分泌形式作用于内皮细胞，促进血管生成。Masferrer等^[13]研究认为，PCa组织中COX-2表达与 VEGF、MVD呈正相关。文献报到LNCaP和PC-3细胞株在缺氧条件下，COX-2表答与 VEGF表答上调关系密切。应用NS398(选择性COX-2抑制剂)可抑制VEGF表达和减少MVD，而外源性PGE2又可逆转NS398的作用。 COX-2活性产物的增加，如PGE2、PEF2、血栓素（TXA2）的增加。可直接促进内皮细胞移位和生长因子诱导的血管生成^[14]。COX-2也可通过激活bcl-2和Akt，抑制内皮细胞调亡，促进新生血管生成。COX-2还可促进aFGF、bFGF、TGF-β、PDGF、iNOS上调有利于血管生成。本研究结果表明，在Pca中，COX-2 、VEGF表达呈正相关（r=0.630,p<0.05）， COX-2 、VEGF表达的阳性组的MVD值明显高于阴性组（p<0.05），有显著性差异，与Masferrer等^[13]报道一致。提示COX-2 、VEGF均参与Pca的血管生成，COX-2主要通过诱导VEGF表达上调，且两者相互协同，共同促进肿瘤血管生成。

COX-2 、VEGF和MVD都是潜在的新型肿瘤标志物，它们的检测可作为Pca恶性程度及预后判断的重要参考依据，以调控COX-2及VEGF活性为靶向的肿瘤治疗，有望成为PCa防治的新途经。

参考文献

1 Rahman MA,Dhar SK, Yamaguchi E, et al. Coexpression of inducible nitric oxide oxide synthase and COX-2 in hepatocellular carcinoma and surrounding liver liver.Clin Cancer Res,2001,46(5):1325-1332

2 Maddaan S, Abcl PD, Chaudhary KS, et al .Cytoplasmic induction and over-expression of Cyclooxygenase-2 in human prostate cancer: implications for prevention and treatment[J]. BJU Int, 2000,86(6):736-741.

3 Ito H, Duxbury M, Benoit E. Prostaglandin E2 enhances pancreatic cancer invasiveness through an Ets-l�dependent induction of matrix�metalloproteinase-2［J］.Cancer Res,2004,64(20):7439-7446.

4 Lin DT,Subbaramaish K,Shah JP,et al.Cyloooxygenase-2:a novel moleculartarget for the prevention and treatment of head and neck cancer.Head Neck,2002,24(8):792-799.

5 Yu J,Tang BD,Leung WK.Different cell kinetic changes in rat stomach cancer after treatment with celecoxib or indomethacin:implications on chemoprevention［J］.World J Gastroenterol,2005,11(1):41-45.

6 adri SS,Wang JH,Coffey JC,et al.Surgically induced accelerated local and distant tumor growth is significantly attenuated by selective COX-2 inhibition［J］.Ann Thorac Surg,2005,79(3):990-995.

7 Tanaka T,Delong PA,Amia K.Treatment of lung cancer using clinically relevant oral doses of the cyclooxygenase-2 inhibitor rofecoxib:potential value as adjuvant therapy after surgery［J］.Aim� Surg,2005,241(1):168-178.9

8 Noda M,Tatsumi Y,Tomizawa M,et al.Effects of etodolac a selective COX-2 inhibitor:on the expression of E2Cadherin2Catenin complex in gastrointestinal cell line［J］.Gastroenterol,2002,37(11):896-904.

9 Song WX, Blan XW, Jiang Xf, et al. Expression of VEGF,EphB4 and EphrinB2 in human gastric cancer and the relationship to tumor angogenesis [J]. Journal of china New Medicine,2004,3(8):13-15.chinese

10 Montironi R, Santinelli A, Mazzucchelli R. Prostatic intraepithelial neoplasia and prostate cancer[J]. Panminerva Med,2002,44(3):213-220

11 Gsllo O, Masini E, Bianchi B, et al .Prognostic significance of cyclooxygenase-2 pathway and angiogenesis in head and neck squamous cell carcinoma. Hum Pathol,2002, 33(7: 708-714)

12 Majima M, Hayashi I, Muramatsu M, et al. cyclooxygenase-2 enhances basic fibroblast growth factor-induced angiogenesis through induction of vascular endothelial growth factor in rat sponge implants. Br J Pharmacol, 2000,130:641-649

13 Masferrer j l, Leahy K M, Koki A T, et al. antiangiogenic and antitumor activities of cyclooxygenase-2 inhibitors. Cancer Res,2000,60(5): 1306-1311

14 Prakono P, Tazawa RM.Gene transfer of thromoboxane A2 synthase prosta-glandin I2 synase antithetically altered tumor angiogenesis tumor growth. Cancer Res,2002,62(1):63-66

分享到：

TA的其他文章：