环氧化酶-2及其抑制剂在前列腺癌中的研究进展

 
  环氧化酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素(PGs)合成过程中一个重要的限速酶[1],可将花生四烯酸(AA)代谢成各种前列腺素类产物,从而维持机体的各种生理病理过程。哺乳动物的COX存在两种同功酶,即COX-1和COX-2,分别由Ptgs-1、Ptgs-2基因编码,具有不同的生物学功能.COX-1是结构表达基因,参与"管家"作用,其mRNA和蛋白质在人体组织内表达水平相对稳定。它催化合成的前列腺素参与机体正常生理过程和保护功能,如参与胃粘膜的保护作用;调节肾血流;控制血小板聚集等。而COX-2是诱导表达基因,其mRNA及蛋白质在正常组织几乎检测不到,但在肿瘤或炎症等病理反应过程中，由于某些细胞因子的作用，促进COX-2的表答增加。近年来大量研究表明，COX-2的过度表答与前列腺癌的发生发展密切相关，有望成为预防和治疗前列腺癌的靶分子，随着COX-2与肿瘤发生发展关系的进一步明确，COX-2抑制剂也成为肿瘤研究的热点。连云港市第二人民医院泌尿外科刘久华

  
1 COX
1.1 COX的组织分布及生理功能
* 作者单位：210029南京，南京医科大学第一附属医院泌尿外科COX有两种同工酶，即COX-1和COX-2，COX-1为结构型酶，在体内分布广泛，普遍存在于众多组织细胞中，定位于内质网附近，促进生理性前列腺素(PGs)的合成，以保持自生稳定和调节组织细胞的正常生理活动，起到“看家”作用（house-keeping）,如保护胃粘膜，防止溃疡的发生，维持肾脏血流及功能，调节血小板的积聚，参与凝血功能[2]。一般情况下，COX-1的活性较稳定，在应激状态下或受某些激素、生长因子刺激时，其活性仅轻度增加2～4倍。COX-2为诱导型酶，只发现于某些细胞中，主要定位于核膜，COX-2产生的PGs产物可以进入细胞核内，调节靶细胞基因的转录。COX-2在静息细胞中检测不到，只有当细胞受到相关刺激后才开使合成，且作用较COX-1缓慢，一般需要数小时至十几小时，但其表答水平较基础水平相比可高达10～80倍

1.2 COX基因及蛋白结构
COX的两种同功酶位于不同的染色体，COX-1基因定位于染色体9q32-33.3,长约22.5kb,由11个外显子和10个内含子构成，编码599～600个氨基酸组成的多肽，属“管家基因”。COX-1由2.8-kbmRNA编码。其在正常组织中持续表达，并不参与肿瘤的发生发展。但也有报到COX-1在人类肿瘤中表答上调。COX-2基因定位于
染色体1q25.2-25.3, 由10个外显子和9个内含子构成[3], 长约8.3kb, 编码604个氨基酸组成的多肽。COX-2由4.5-kbmRNA编码。COX-1 与COX-2的氨基酸序列约60?同源。两者的区别在于以下几个方面：⑴ COX-2编码的多肽N端缺少COX-1中大的疏水性信号肽，取而带之的是较短的粘性信号肽；⑵ COX-2氨基酸序列C端有一特异的18个氨基酸片段，人工合成这个特异性的18肽片段治备抗体，可以检测COX-2蛋白 （3）COX-1和COX-2活性位点的颉氨基酸509至异亮氨酸的单个氨基酸不同。

1.3 COX-2表答调控
  刺激诱导COX-2表答的因素存在于细胞内外，包括多种生长因子和/或细胞因子，如肿瘤坏死因子（TNF），转化生长因子（TGF），碱性成纤维生长因子（bFGF）,内皮生长因子（EGF）,血清、促瘤剂如佛波脂（TBA、PMA）、癌基因如V-src、ras,人类绒毛膜促性腺激素、内皮素（ET）、一氧化氮（NO）、丝裂原等。各种刺激因子通过G蛋白偶联机制、TBA活化的蛋白激酶C介导的通路以及生长因子受体、V-src癌基因产物pp60v-src活化酪氨酸激酶介导的通路刺激诱导COX-2的基因表答。P53基因或ras基因突变的细胞COX-2表答也增强，但正常的P53基因的产物可抑制COX-2的表答。非甾体类抗炎药（NSAIDs）、选择性COX-2抑制剂、糖皮质激素、一些抗氧化剂等均可抑制COX-2的表答。有研究发现癌基因K-ras通过激活Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt/PKB两条途径诱导COX-2的表答，其中MEK在COX-2 mRNA转录增加及稳定中起主要作用，而Akt/PKB活性主要与稳定COX-2 mRNA有关[4]。实验证明磷酸化酶抑制剂OKA可通过MAPK-AP-1和PKA-CREB、AIF两种途径促进COX-2基因转录，同时伴有原癌基因c-jun、c-fos等的上调[5,6]。致癌剂二羟基胆酸也能促进c-jun的磷酸化从而促进AP-1结合DNA, 诱导COX-2的表答。相反，糖皮质激素则通过抑制AP-1的活性而抑制EFG、LPS、促瘤剂等对COX-2上调作用。

 

2 COX-2与前列腺癌的关系

  20世纪80年代，许多临床及流行病学研究表明 ，长期使用阿斯匹林可以降低结肠癌的发生率，从而研究者将COX-2和肿瘤联系起来。近年来，流行病学调查、体外的药理实验、体内的动物实验和临床研究均表明COX-2的表答在前列腺癌发生中起重要作用。而服用NSAIDs与前列腺癌的危险性呈负相关。Robert等调查明尼苏达州例患者发现，日常服用NSAIDs的人前列腺癌发病率较低，在70～79岁年龄组相关系数为0.17[7]。Nelson和 Harris报道处方或非处方NSAIDs使前列腺癌的相对危险性（RR）降低（分别为0.35和 0.34[8]。Yoshimura等采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）和免疫组化方法检侧了28例前列腺癌标本中COX-1和 COX-2的表答，发现COX-1弱表答，而COX-2表答明显强，而8例正常前列腺和8例良性前列腺增生症中COX-1和 COX-2均为弱表答，具有显著差异（p<0.01）,提示COX-2的过度表答在前列腺癌发生中起某种重要作用[9]。Madaan等采用免疫组化及免疫印记法对82例前列腺癌和32例良性前列腺增生症标本进行检测，发现在前列腺增生和前列腺癌组织中，COX-1的表答水平基本一致，而COX-2在两种组织中的表答差异显著，在分化差的肿瘤细胞中的表答较分化好的肿瘤细胞差异显著（p<0,01）[10]。这一结果被免疫印记法证实，并显示前列腺癌中COX-2的含量是前列腺增生的四倍。Eastham、Gupta等也报道，采用免疫组织化学方法发现人前列腺癌组织中COX-2持续高表答，在伴有淋巴结转移的患者中表答更为明显，提示COX-2对前列腺癌的早期发病和进展中起着重要作用[11、12]。体外实验也证实了COX-2的表答与前列腺癌的分期、分级相关，COX-2在激素依赖型细胞株LNCaP和激素非依赖型细胞株PC-3均呈较高水平表答 [13、14]。以上报道均说明COX-2在前列腺癌变过程中起重要作用。但是近年来也有一些研究发现癌组织及前列腺上皮内肿瘤（PIN）中，COX-2的表答水平没有高于癌旁组织，且在肿瘤组织和正常组织中，COX-2仅在一些散在细胞中表答，而在前列腺癌的前体病变（增生性炎性萎缩区）并没有过多表答[15]COX-2与前列腺癌的肿瘤发生发展蜜切相关，但COX-2的作用机制还不太清楚，目前认为其作用机制与促进肿瘤血管生成、抑制细胞调亡、免疫抑制有关。

2.1 促进前列腺癌血管生成

  COX-2影响肿瘤形成的最重要的功能可能是促进肿瘤细胞的血管形成，血管形成是肿瘤发生发展、转移必不可少的前提条件，其促进血管形成的机制可能有以下四个方面。① COX-2催化花生四烯酸生成PGE2, PGE2作用于相应的受体EP2,使细胞内cAMP增加，诱导生成VEGF。VEGF作用于内皮细胞表面的受体，从而促进血管生成。同时VEGF 可上调COX-2的表答，从而形成一个正反馈网络[16] Masferrer等[17]研究认为，前列腺癌组织中COX-2表答与 VEGF、
微血管密度（MVD）呈正相关。Kirkpatrick等〔18〕发现PG可以诱导bFGF及VEGF的表达，使其mRNA水平明显增高，并且这种增加可以被COX-2抑制剂和VEGF的反义寡核苷酸所抑制。Gallo等[19]研究发现，在上皮肿瘤细胞系中COX-2可以快速诱导VEGF mRNA和蛋白的产生。Liu报到在LNCaP和PC-3细胞株中缺氧诱导COX-2表答与 VEGF表答上调关系密切[13]。应用NS398(选择性COX-2抑制剂)可抑制VEGF表达和降少肿瘤微血管密度（MVD），而外源性PGE2可逆转NS398的作用。② COX-2活性产物的增加，如PGE2、PEF2、血栓素（TXA2），这些物质可直接促进内皮细胞移位和生长因子诱导的血管生成[20]。Majima等[21] 研究发现PGE2、PEF2增加的同时，VEGF mRNA的生成也增加 ，VEGF以旁分泌形式作用于内皮细胞，促进血管生成。③COX-2可通过激活bcl-2和Akt，抑制内皮细胞
调亡，促进新生血管生成[14]。④ COX-2可促进aFGF、bFGF、TGF-β、PDGF、iNOS上调有利于血管生成。

2.2 促进肿瘤细胞增生、抑制细胞凋亡

  研究证实，COX-2的前列腺素产物可增强正常和肿瘤细胞增殖和生长，许多实验表明前列腺素参与调控细胞的生长和分化，COX-2高水平表答，催化合成的大量PG可导致肿瘤细胞增生。COX-2还可通过诱导表皮生长因子(EGF)受体，使细胞对生长因子的敏感性增加，以减少NO信号传递，从而影响细胞增殖作用，COX-2抑制剂可阻断此作用[22]。COX-2通过催化合成前列腺素的反应，消耗了作为诱导调亡信号之一的花生四烯酸，从而降低caspase-3的活性，起到抑制细胞凋亡作用。COX-2可上调凋亡抑制基因Bcl-2的表答, 降低介导凋亡的转化生长因子TGFβ2受体的水平，同时激活抗凋亡关键激酶Akt, 抑制肿瘤细胞凋亡。PGE2和其它前列腺素类物质还可提高细胞内 cAMP浓度而抑制细胞凋亡。也有研究认为，COX-2还可通过KappaB通路以及与一种核蛋白 Nucleobindin直接作用抑制细胞凋亡。Moalic S〔23〕等用选择性COX -2抑制剂NS398作用于同类型的三种肿瘤细胞系，结果发现NS398产生明显的抗细胞增殖和诱导早期凋亡的作用。Roberts EG〔24〕等用refecoxib和NS398分别2种乳腺癌细胞（MCF-7，ZR75-1）和2种前列腺癌细胞（PC-3，DU145）24、72 h后，用噻唑蓝染色检测细胞抑制率，结果所有肿瘤细胞生长被显著的抑制，抑制呈剂量依赖型。Hsu等[14]及报到高选择性COX-2抑制剂celecoxib可阻断Akt的磷酸化，从而引起 LNCaP 和PC-3细胞凋亡。Nzeako等[25]认为，抑制COX ?2的蛋白表答，可能有助于增加Fas介导的细胞凋亡。

2.3免疫抑制作用

  肿瘤细胞COX-2高表答，其催化产物PGE2和组胺增加，通过cAMP介导可抑制中性粒细胞侵袭、单核巨嗜细胞的活性、抑制IL2 受体和IFNγ受体的表答，并引起细胞因子分泌矢衡，使机体对细胞的免疫监视功能下降，细胞杀伤能力降低，使肿瘤细胞逃避免疫监视，有利于免疫监视的侵袭转移。此外，PGs还能抑制T、 B淋巴细胞的增生，减少肿瘤坏死因子（TNF）的量[26],减少细胞分裂素和其它免疫调节物影响宿主对肿瘤的监视作用。研究发现，前列腺素类物质可激活癌基因c-myc和上皮生长因子，可独立诱导移位突变和其它突变活性，细胞逃避免疫监视。

2.4促进前列腺癌的浸润和转移

  COX-2促进前列腺癌的浸润和转移的机制包括以下几个方面，①COX-2促进肿瘤细胞增殖和新生血管形成；② COX-2通过降低介导细胞间粘附的E-钙蛋白活性、上调肿瘤细胞基质金属蛋白酶（MMP）、催化形成促血小板凝聚的血栓烷以及尿激酶型纤溶酶原激活酶（uPA）的表答上调,发挥促进转移的作用；③ COX-2还可通过直接导致肿瘤细胞表型改变而促进肿瘤细胞转移[27]；④ COX-2还可上调Bcl-2的表答诱导前列腺癌细胞向激素非依赖型转化[28]。⑤实验还发现PGE2也可以增加细胞迁移和侵袭力[29]。Noda等〔30〕研究显示一种选择性的COX-2抑制剂etodolac可以上调CaCO-2、HT-9等细胞系E2钙粘素(E-dherin)的表达并显著降低细胞的增殖和转移。

2.5 COX-2催化生成的PGs及其中间产物，促进肿瘤的发生发展

  COX-2催化生成的PGs，可直接促进前列腺癌细胞生长，又可通过正反馈作用于COX-2，使其表答上调，合成更多的PGs，加强促肿瘤生长的进程。COX-2催化氨基酸形成具有诱变作用的丙二醛，直接激活癌基因或引起p53等抑癌基因突变诱发肿瘤。COX-2催化生成PGs的反应中有许多中间产物具有高度活性，（如自由基、活性氧等），它们能与生物大分子DNA等作用，提高细胞突变的可能性，从而诱发肿瘤[31]。Nikolic等[32]发现，COX-2催化反应中DNA和（或） 核苷磷酸化酶能被氧化，导致8-氧-2-脱氧鸟苷含量显著增加，而这一过程可被COX-2抑制剂或抗氧化剂阻断。此外，有许多化合物（如雌激素）作为辅助因子，在反应中被氧化，这些氧化的辅助因子可能也参与肿瘤的发生发展。3 COX-2抑制剂在前列腺癌治疗中的作用 选择性COX-2抑制剂和非选择性COX抑制剂，除了具有抗炎镇痛的作用之外，最近的研究发现它们还具有抗肿瘤的作用，流行病学及动物实验研究证明，环氧化酶-2抑制剂可降低肿瘤的发生率并预防肿瘤的形成〔33〕，而且研究发现，在手术切除后使用环氧化酶-2抑制剂可以明显抑制肺癌的复发和全身的转移〔34、35〕。近年来，一些流行病学研究表明，长期使用NSAIDs在前列腺癌的治疗和预防中均发挥作用[7、8]。 

3.1 COX-2抑制剂的抗肿瘤机理

  COX-2抑制剂有效的抑制了COX-2的活性，诱导肿瘤细胞凋亡，减少了对肿瘤生长和转移具有明显促进作用的PGE2或其它PGS的产生，抑制肿瘤细胞增殖，减少新生血管的形成，降低血管的通透性，从而达到抗肿瘤作用。也有研究表明，选择性COX-2抑制剂与化疗药物联合应用可增强化疗药物的敏感性，还能增强肿瘤细胞对放疗的敏感性。环氧化酶-2抑制剂对肿瘤细胞的抑制作用的机理还有很多争论〔36〕。有些研究表明环氧化酶-2抑制剂抗肿瘤增殖和诱导凋亡作用机理中均涉及到COX-2依赖和非COX-2依赖途径〔37、38〕，并不完全依赖COX-2，另外还有独立的过程，在此过程中合成PGE途径是不重要的。Patel MI〔39〕等使用Celecoxib 和refecoxib两种COX-2抑制剂作用于PC3和LNCaP两种前列腺癌细胞系来观察体外其对细胞生长的抑制效应，使用Celecoxib 评估移植模型的抑制效应。结果两种细胞中同时检测到COX-1，却没有COX-2。在25～50 μmCelecoxib 体外抑制细胞的生长；然而refecoxib在此浓度对肿瘤细胞无抑制作用。Celecoxib 诱导G(1)期阻滞，阻滞脱氧核糖核酸合成。Celecoxib 对PC3移植肿瘤的抑制呈现剂量依赖型，但没有导致瘤内前列腺素E(2)的降低，而血浆浓度在237～570 μm时可以阻碍实体肿瘤的生长，这与体外需要抑制肿瘤细胞的浓度相当。最高浓度的Celecoxib 使肿瘤体积减少52%，使细胞增殖数量和微血管密度减少50％。Celecoxib 作用两种细胞和移植瘤使细胞周期蛋白D1显著减少，由此可见，两种临床上有效的COX-2抑制剂抑制肿瘤具有不同的非COX-2依赖途径。而 Celecoxib 拥有COX-2依赖和非COX-2依赖途径两种特性。一些研究者提出Celecoxib 可干扰细胞调节的抗凋亡激酶和内质网的Ca2+-三磷酸腺苷诱导前列腺癌细胞凋亡。阻断这些信号通路与NSAIDs所致的凋亡机制是不同的。也有研究认为COX-2抑制剂在前列腺癌中。具有激素非依赖性抗肿瘤作用。

3.2 COX-2抑制剂的副作用

  非选择性COX抑制剂由于抑制了COX-1，从而减少正常生理所需的前列腺素类物质的合成，产生一些毒副作用，如造成严重的胃肠道疾患，包括溃疡、出血和穿孔；引起血管收缩、肾血流量及肾小球滤过率下降。选择性COX-2抑制剂没有这些副作用，而具有良好的治疗作用，在肿瘤的靶向治疗上受到广泛的关注。但近年也有研究发现COX-2具有一定的潜在危险，主要表现在以下几个方面。①COX也有稳定的过氧化酶活性，能将一些具有致癌性的酶的产物氧化使其失活，一旦这个氧化被选择性或非选择性COX-2抑制剂不必阻断后，有可能促进肿瘤细胞增生[40]②COX-2对病理状态下的前列腺环素的生成有重要作用，COX-2抑制剂可减少动脉粥样硬化中前列腺环素代谢，从而抑制了保护性的血小板激活机制，使肌细胞易受到氧化物的损害。③ 研究还表明，COX-2抑制剂使发生确定性心血管事件的相对危险增加了，COX－2抑制剂会抑制前列腺素I2的产生，而前列腺素I2是一种心脏保护物质。COX－2还发挥着别的重要的生理作用，包括骨愈合、肌腱断裂的修复、心脏的血液供应等，阻断COX－2有可能引起一些意想不到的副反应。起一些意想不到的副反应。

4 结语和展望

前列腺癌的发生发展是由多基因、多因素、多步骤协同作用的结果。目前研究认为COX－2在前列腺癌的发生发展中起重要作用，但COX－2与前列腺癌的关系及内在作用机制还不完全清楚。以COX－2为靶分子的COX－2抑制剂受到广泛重视。随着对COX－2研究的深入，将进一步揭示肿瘤发生的分子机制，研究开发新的
COX－2抑制剂，高活性且高选择性的COX-2不可逆抑制剂将是未来短期内新型COX-2选择性抑制剂研究的一个主要方向。
  刘久华* 综述 张炜* 审校
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