稳定性同位素示踪技术研究进展及其在糖脂代谢研究中的应用

1 同位素示踪技术和稳定性同位素示踪技术

 

同位素示踪技术是一项成熟的技术，其应用于生物医学、药物研发、营养代谢领域已有100多年历史，是这些领域的不可缺少的重要研究手段^[1]。所谓同位素示踪技术（isotope tracer technique）是从外面加入与生物体内的元素或物质完全共同运行的示踪物，用以追踪生物体内某元素或某物质的运行或变化的一种方法。同位素可分为放射性同位素或稳定性同位素。检测以同位素的辐射能或质量的差异为目标。放射性同位素的优点是灵敏度高，测量方法简便易行，缺点有辐射线效应，应注意屏蔽。非放射性同位素(non-radioactive isotope)又称稳定同位素(stable isotope)，或绿色同位素，如碳-13 (¹³C)、氮-15 (¹⁵N)、氘(²H) 和氧-17/18 (¹⁷O/¹⁸O)，存在于自然界而无辐射污染，可安全地用于婴儿和孕妇，但作为示踪剂其可获得的种类少，价格较昂贵，其故应用范围受到一定限制，近30年来才逐渐应用于医学领域^[2-4]。上海交通大学医学院附属第九人民医院内分泌科陆颖理

 

稳定同位素的检出测定一般是较困难的，常用的检测分析技术有：核磁共振(NMR)分析技术^[5]，该技术使不易被检测到的分子化合物在较高磁场强度下被检测到，然而其检测灵敏度相对较低。气相色谱与质谱联用(GC/MS) ^[6}是基于色谱和质谱技术的基础上，充分利用气相色谱对复杂有机化合物的高效分离能力和质谱对化合物的准确鉴定能力进行定性和定量分析的一门技术。该技术能使样品的分离、鉴定和定量一次快速地完成，它主要适用于分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物。液相色谱与质谱联用(LC/MS) ^[7]同GC/MS相比，主要解决不挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子量化合物（包括蛋白质、多肽、多聚物等）的分析测定问题。

 

2 稳定性同位素示踪剂应用于糖脂代谢研究的意义

 

糖尿病是一种以糖代谢失常为主的内分泌代谢性疾病，通常表现为整体的代谢紊乱(包括糖、脂、氨基酸代谢紊乱等)，因此，非常适合应用稳定同位素示踪技术来弄清代谢物质的来龙去脉^[8]。该技术的特点是测试的高精度和超高精度, 可达到接近PPM级（百万分之一),它不但能追踪化合物的整个分子，还能追踪其某个原子，比如葡萄糖分子各个原子的不同代谢途径, 哪些原子进入了三羧酸循环产生能量，而哪些原子用于脂肪酸的合成等。早在上世纪70年代，Bier等^[9]就在动物和成人中使用¹³C和²H标记的稳定性同位素（双标记法）通过GC/MS监测体内葡萄糖和丙氨酸的代谢。   

 

2.1 糖代谢异常相关机理的研究：稳定性同位素可以追踪肠道葡萄糖吸收、肝脏葡萄糖输出、外围组织（如肌肉、脂肪）的葡萄糖摄取的代谢过程。Mayo 实验室研究发现“轻微”或“严重”的2型糖尿病患者空腹血糖产生和消失都存在异常^[10]。其应用1-¹³C，6-³H和6,6 -²H2葡萄糖三标法，使示踪剂比被示踪物比例(tracer-to-tracee ratio，TTR)达到最小，从而更精确反应了餐后血浆葡萄糖的出现(Ra meal)和内源性葡萄糖的产生(EGP)^[11]。近期有学者^[12]用 U-¹³C标记葡萄糖，采用核磁共振技术，发现长期血糖控制不良的1型糖尿病和持续应用胰岛素泵血糖控制尚平稳的1型糖尿病患者对比，持续皮下胰岛素治疗可以明显减少肝脏内源性葡萄糖产生，改善糖异生作用，提示长期血糖控制不良的T1DM肝糖代谢并非不可逆。

 

2.2 脂代谢异常相关机理的研究：稳定性同位素可以追踪不同阶段脂质合成、脂肪分解、脂肪酸氧化的变化。在肥胖伴有2型糖尿病患者与单纯肥胖患者的比较中发现，前者胰岛素抑制脂肪分解作用明显受损^[13]。McQuaid等^[14]用U-¹³C标记棕榈酸、亚麻油酸、油酸示踪，在腹型肥胖和体型偏瘦的正常人中比较发现，肥胖患者脂肪组织量增多，而其脂肪组织储存脂肪的能力则明显下降。从而进一步导致血浆FFA水平明显增加和异位脂肪沉积。目前认为腹部脂肪堆积引起局部性糖皮质激素增多进一步加重脂毒性和胰岛素抵抗。Basu等^[15]在正常人中肝静脉中注射[9,11,12,12-²H₄]氢化可的松(D4-氢化可的松)，可的松通过11β羟类固醇脱氢酶1型途径生成氢化可的松，发现内脏氢化可的松的产生和身体其余部分产生量基本相当。然而肥胖患者（不管是否伴有2型糖尿病）其内脏氢化可的松产生量明显增加^[16]。

 

2.3 糖尿病治疗相关药物的研究评价：稳定性同位素示踪技术的研究方法可用于评价药物对糖尿病的作用，包括药物的治疗效果、时间和剂量效应及分析患者服药前后的生化指标等方面。曾有研究者^[17]应用稳定性同位素示综技术发现2型糖尿病的治疗药物噻唑烷二酮类药物，在服用后期，由于骨吸收加快及骨形成减缓，可引起骨质疏松症，使患者骨折的风险增加。Mayo 实验室研究发现^[18]老年患者中应用脱氢表雄酮替代治疗2年，并不能改善胰岛素分泌、肝胰岛素清除和餐后糖代谢异常。我们课题组应用稳定性同位素示踪技术发现应用GLP-1激动剂干预糖尿病大鼠其糖脂代谢的改变，相关研究结果已整理待发表。

 

3 本课题组应用稳定性同位素示踪技术研究糖脂代谢的成果及科研方向

 

本课题组成功制作糖尿病大鼠、多囊卵巢综合症大鼠及低雄激素大鼠的稳定性同位素示踪技术模型。在多囊卵巢综合症大鼠中^[19]，应用1,2,3-¹³C葡萄糖、U-¹³C甘油、6,6-²H葡萄糖示踪，发现雄激素或高脂诱导的多囊卵巢大鼠虽然血糖水平较正常组无明显差异，但血浆胰岛素浓度明显增高，同时应用雄激素及饮食高脂诱导的大鼠胰岛素抵抗尤其明显。卵巢呈多囊表现，血脂升高，无明显发情期，血浆中葡萄糖出现率和糖异生明显升高。

 

下一个课题拟采用高脂诱导肥胖大鼠模型，在大鼠肥胖形成过程的不同阶段，进行动态的血糖、血脂代谢的状态研究：（1）用稳定性同位素示踪剂来研究高脂喂养的肥胖大鼠葡萄糖代谢紊乱发生过程中肠道葡萄糖吸收率、肝脏葡萄糖输出率、组织的葡萄糖摄取率变化程度及可能的时间顺序，以及三者对糖代谢紊乱的贡献程度，阐述肥胖时糖代谢紊乱的机制；（2）探讨高脂诱导肥胖大鼠在肥胖不同阶段脂质合成、脂肪分解、脂肪酸氧化的变化，了解肥胖大鼠脂质代谢紊乱的发病机理；（3）以三碳糖（Pyruvate,Glycerol即甘油等）作为前体的新葡萄糖的合成，研究形成糖异生的途径，探讨脂代谢紊乱对糖代谢的影响。

 

参考文献：

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Elucidation of cellular metabolism via metabolomics and stable-isotope assisted metabolomics.

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