阻断细胞因子的信号传递

　　极限肝切除手术后患者死亡率较高，主要是由于术后短期内肝脏无法进行有效的代偿，引起爆发性肝衰竭所致，对此目前尚未发现效果良好的治疗措施，故保护术后肝功能、增加术后存活率已成为肝脏外科中一个重要的课题，是研究的重点之一。

　　研究表明，重大手术和严重创伤，包括扩大肝切除能造成炎症介质的过度释放，引起炎症级联反应(Inflammatory Cytokine Cascade)1,2。许多促炎因子，如IL-6、TNF-a等的过度表达对局部和全身的组织造成了损害，同时也影响了剩余肝脏的功能，阻碍其恢复。细胞因子受体超家族信号传递的必经途径是Jak-Stat信号通路，阻断此通路能特异性地抑制炎症效应。AG490 [a-氰-(3，4-二羟基)-N-苄基肉桂酰胺] 是Jak-2蛋白激酶的特异阻滞剂3，实验已表明它对Jak-Stat的阻断曾经治愈了动物模型中与过度细胞繁殖有关的白血病4。AG490是否能通过它对炎症介质的阻断，保护剩余肝细胞免受过度炎症反应的损害、增加极限肝切除术后的存活率，此问题目前尚未被证实。

　　研究发现有多个体内调节蛋白与术后肝功能密切相关，其中P21-RAS(WAF1、CIP1、SDI1)蛋白起到非常重要的作用5。现已明确肝切除手术后P21-RAS有异常的高表达，其结果是特异性地抑制肝细胞的功能­6。Lovastatin类药(3-羟基，3-甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂)有降血脂的功能，它能阻断P21-RAS的细胞内信号传递7，理论上可能促进肝切除术后的肝细胞功能，增加存活率。Ponder及其助手已在动物模型中证实了Lovastatin的这种作用8。在此类辅酶A还原酶抑制剂药物中，Atorvastatin的作用要明显强于Lovastatin9，但它对肝脏切除术后肝功能的保护作用未被证实。

　　本研究在大鼠90％肝切除的模型中，在国际、国内首次探明了AG490和Atorvastatin对术后存活情况的影响。

　　材料与方法

　　1.实验动物

　　Sprague-Dawley雄性大鼠，体重220-270g，由中国医学科学院实验动物中心提供。动物在控制温度、湿度及12小时照明与12小时黑暗交替的环境中饲养，允许随时自由食用固定标准饲料和清水。

　　2.药品与器材

　　手术器械由协和医院外科和动物中心提供。

　　AG490购自Calbiochem公司(San Diego, CA, USA)，每5mg用5ml DMSO-

　　15ml ddH2O充分溶解，每次注射1mg/kg BW。

　　Atorvastatin 10mg/片(北京辉瑞制药有限公司惠赠)，每片研磨至粉末状固体，用0.9％生理盐水3ml溶解成均匀的悬浊液，每次给20mg/kg BW。

　　3.实验分组

　　(1)生存率与生存时间：大鼠30只随机分为3组。Ctrl组(n=10)：术前1天胃管予0.9％生理盐水1.5ml，术后零时及术后1、2、3天各给一次。AG490组(n=16)：术后零时及术后12、24、36小时各腹腔注射AG490溶液1ml。Ator组(n=16)：术前1天胃管予Atorvastatin悬浊液1.5ml，术后零时及术后1、2、3天各给一次。

　　(2)血清生化指标：另取大鼠分为AG490组和Ctrl组，给药方式同上。

　　(3)各取5只大鼠，分别测每日体重增长量和肝脏占体重的百分数。

　　4.手术处理

　　大鼠90％肝切除：根据Emond等的方法10，清洁手术，在9：00-17：00之间进行。上腹部正中切口，丝线分别结扎外侧叶、中叶、右下叶及右上叶，并予切除。观察剩下的尾状叶无淤血后关腹。

　　5.检测内容

　　(1)生存率与生存时间：计手术关腹为零时，取时间点术后1、2、3……19、20、22、24、28、32、40、48、60小时，及术后3-7天观察。

　　(2)体重变化：术后每天称量各组大鼠体重，与正常大鼠对比。

　　(3)肝再生情况：

　　① 对72小时内死亡的大鼠及处死的长期存活大鼠立即进行解剖并称出肝尾状叶重量，用以下公式计算肝再生率：

　　Liver Regeneration Rate(％)=100х[C-(A-B)]11

　　其中A为估算的手术时肝重：预先取5只相当重量的SD雄性大鼠，测得正常大鼠肝脏占体重为4.2±0.1％，以此乘以各组大鼠手术前体重。B为切除的肝叶重量即术前、术后体重差值。C为剩余的肝尾状叶重量。

　　② 取不同时间点大鼠的肝脏，在组织病理学上分别进行H.E.染色和PCNA染色，观察肝细胞破坏和再生情况。于高倍显微镜下观察5个视野，每个视野中随机选取100个肝细胞，计数其中PCNA(+)细胞的个数并取平均值，间接反映肝脏再生能力。

　　(4)Ctrl及AG490组大鼠术后8、12、24、48、72、96、120小时从眶后静脉丛取血0.5-1ml;死前从心室取血处死并取肝脏组织低温保存。所得血样常温下3000 X g离心5-10分钟，取上层血清送协和医院检验科生化实验室测血糖、TP、Alb、TBil、DBil、Alt和Ast水平。

　　6.统计学方法：应用SPSS 11.0.0标准版(SPSS Inc.) 统计软件进行统计。数据以Mean ± SEM来表达，经过Student-t检验后，以p<0.05为显著性差异。

　　结果

　　(1)大鼠在90％肝切除后均能从麻醉中苏醒并至少存活5小时。在对照组中死亡率为100％，平均存活时间为10.7±1.9小时，在存活的时间内大鼠已开始饮水并进少量食物。在死亡的大鼠尸体解剖时均未发现有术后的大出血或血管栓塞等并发症，证明大鼠的死亡是由于术后的肝功能衰竭而引起。Atorvastatin的应用明显地延长了大鼠的存活时间(25.6±4.5 vs. 10.7±1.9, p<0.05，见图1)。AG490的腹腔内注射起到了更为明显的效果(30.6± 6.3vs. 10.7±1.9, p<0.05，见图1)，而且有生存率的变化(25％ vs 0，见图2)。

　　(2)术后Ator组和AG490组大鼠体重均有明显下降，AG490组大鼠的体重在术后第三天达最低点，后逐渐回升(图3)。

　　(3)病理组织切片H.E.染色可见术后剩余肝脏破坏，肝细胞变性、坏死(图4);PCNA染色未见术后48小时内肝细胞明显增生(图5)。PCNA计数和肝再生率的变化趋势略有不同，但都反映出术后72小时肝脏的再生已经起到部分代偿的作用，术后120小时肝脏再生明显，基本上可以代偿(图6)。而且对存活超过7天的大鼠进行解剖，发现肝脏的增生已经超过了术前的1/2左右。

　　(4)术后8小时、12小时AG490组与Ctrl组大鼠相比，血糖、Alt、Ast水平有显著改善，更接近正常值(图7-9);但TP、Alb和胆红素水平无明显变化。而随着生存时间的拉长，所有血清生化指标逐渐接近正常值。

　　讨论

　　临床上，对于那些有巨大肝脏占位病变的患者，扩大肝切除是唯一有希望治愈的手段，但此时患者常合并肝硬化等肝脏疾病，总体体质也常较差，故这种所谓极限肝切除风险极高，如在术后引起爆发性肝功能衰竭，死亡率可达70％-90％12。如何保护此类手术后肝脏的功能，使其度过前48小时的风险期是肝脏外科的一个难题。肝脏切除术后，现今保护和维持肝功能的方法不外于人功肝支持、促进肝脏的再生、各种营养物质的支持和增强残存肝细胞功能并改善其环境等。现有的人功肝支持只能代偿肝脏的解毒功能，而不牵涉到肝脏制造各种蛋白和凝血因子的作用。促使肝脏的再生可能是一个彻底而有效的途径，但是手术后短期内，尤其是前48小时肝脏的增生能否具有足够代偿其功能的意义，还是一个明显的问题。实验中我们发现，手术后短期内，Ctrl组大鼠血浆中Alt和Ast的水平极度升高，此时肝脏尽管有一定再生，却并不能补偿所被破坏的肝细胞数量和功能从而减少大鼠的死亡。此时，需要寻找合适而有效的措施帮助残留的肝脏度过这段风险期，临床上的包括多种维生素的营养支持已被广泛应用，而此时增强残余肝细胞的功能改善其生存环境，如阻断过度炎症反应显得尤为重要。本研究在国际、国内首先证明了通过阻断细胞因子信号传递的方法延长了90％肝切除后大鼠的生存时间。

　　本研究采用了标准的大鼠90％肝切除模型，它是根据Emond方法切除肝脏各叶，仅留尾状叶。以往的实验表明90％肝切除后的大鼠短期内死亡率为100％13。采用这个极限肝叶切除模型目的是要造成极度的不可逆的肝脏损害，以此来检验各种药物的功效。

　　Atorvastatin抑制了P21-RAS的信号传导，阻断了后者对肝细胞功能的特异性损害，结果延长的手术后大鼠的生存时间。由于此药目前在临床上已经被使用，主要用于对高血脂患者的降血脂作用，它的临床使用安全性已被证实，因此本实验的结果为以后在重大肝手术患者术后直接辅助使用Atorvastatin来保护肝细胞的功能提供了一定的依据。

　　作者在此研究前考虑过炎症介质的过度表达对全身脏器包括肝脏的损害，但现有的抑制各种炎症反应的药物较多，然而具特异性抑制的并不多见。在预实验中作者曾应用了诸如非甾体类抗炎药等抑制剂，但初步效果均不明显。AG490是特异性的细胞因子信号传递(Jak-Stat)阻断剂，尚未开始应用于临床。我们最后选择了这种特异性的阻断剂，实验结果显示了意料之外的良好的效果，术后大鼠存活率提高到25％，且有血浆Glu、Alt、Ast水平的显著改善，其效果甚至优于Atorvastatin。可见，扩大肝切除术后过度的炎症反应对剩余肝细胞的破坏作用在术后的康复中是如此的重要。

　　AG490的应用和极限肝切除术后阻断炎症介质的概念，为类似药物在临床上的应用打下了一定基础。

　　图3、体重变化

　　25

　　图6、肝脏再生指标

　　图5、PCNA染色

　　图4、H.E.染色

　　图1、三组大鼠生存时间比较

　　图2、三组大鼠生存率比较

　　图9、Ast 变化

　　图8、Alt 变化

　　图7、血糖变化

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