- 脑缺血再灌注后水通道蛋白4动态变化的研究
- 作者:孙基栋|发布时间:2011-06-22|浏览量:805次
脑水肿与缺血性脑血管疾病的致残率、病死率有很大关系。水通道蛋白(AQPs) 可能在脑组织水转运过程中起关键作用,与脑水肿的发生密切相关[1]。本研究采用大鼠缺血再灌注模型,研究不同的缺血时间与再灌注时间影响下AQP4的表达变化及其可能的意义。清华大学玉泉医院神经外科孙基栋
材料和方法
一、大鼠分组
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠91只,体重230±20 g。随机分为假手术组(7只)和脑缺血再灌注组(84只);脑缺血再灌注组又分为脑缺血2h、3h、6h后再灌12h、24h、3d、7d,共12个亚组(每组7只)。
二、缺血再灌注模型制备
采用改良的Longa线栓法建立大鼠局灶脑缺血再灌注模型。10 %水合氯醛(400mg/ kg) 溶液腹腔注射,麻醉大鼠。颈部正中纵向切口,充分暴露左侧颈总动脉,分离颈外动脉及颈内动脉,在颈外动脉根部结扎颈外动脉;近心端结扎左侧颈总动脉,动脉夹夹闭颈总动脉远端,在结扎线和动脉夹之间的颈总动脉上剪一小切口,切口远端打一松扣,将一头端烧成球形的直径0.165mm的尼龙线插入切口,缚紧切口远端之丝线,松开动脉夹,将钓鱼线缓慢向颈内动脉入颅的方向推进,至有阻力不能再进为止。将尼龙线尾端留在皮外,再灌注时拔出插线。假手术组除不进线外,全过程同缺血组。按照Longa的5分法进行神经病学评分: 0 分,无神经缺损症状,活动正常;1 分,右前肢不能完全伸直;2 分,侧推抵抗力减弱,向右旋转;3 分,向右侧倾倒;4 分,不能自发行走,意识丧失。其中,0分和4分者被剔除,随机补充,保持每组7只不变。
三、脑组织处理及免疫组化
将各组大鼠于各相应时间点以10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉,打开胸腔充分暴露心脏,经右心室插管至主动脉,固定插管并剪开右心耳,先用100ml 0.9%温生理盐水经插管冲洗血管内血液,至右心耳流出的液体澄清后,再灌注4%的多聚甲醛200ml,断头取脑,固定、脱水、石蜡包埋,常规HE染色及免疫组化检测。小鼠抗大鼠AQP4单克隆抗体AQP4(浓度1∶100)购于Santacruz公司。实验过程严格按照试剂盒说明进行。以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。
四、统计学处理
大鼠AQP4免疫组化图像分析: 光镜下对每张切片于梗死灶周边半暗带选择10个高倍视野,用计算机图像分析处理软件Motic images advanced 3.0检测受检区AQP4显色的面积比(即阳性区面积与总面积的比例)。
采用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。数据均以 表示。采用析因设计的方差分析,P < 0.05表示有统计学意义。
结 果
一、HE染色结果
假手术组,未见神经元病理组织学改变。缺血再灌注组:梗死灶主要位于大鼠左侧大脑顶叶、颞叶及基底节区,呈典型的液化性坏死改变。随着缺血时间的延长神经毡溶解增加,组织疏松淡染,大量神经元坏死消失,残存神经元胞体缩小,胞核固缩呈三角形,核仁消失。
二、免疫组化染色结果
AQP4在假手术组鼠脑主要在脑实质内血管周围星形胶质细胞 (图1),侧脑室及第三脑室室管膜细胞、脉络从上皮细胞(图2)呈阳性表达,未见神经元着色。缺血组梗死灶中心无表达,而在梗死灶周围高表达,主要表达于血管周围星形胶质细胞,部分神经元也可见阳性表达(图3)。
三、统计学分析结果
缺血再灌注各组脑内AQP4表达较假手术组均明显升高。在缺血与再灌注双重因素影响下,AQP4蛋白表达与缺血时间、再灌注时间均有相关性(表1-2,图4,p值分别为p<0.001,p<0.05)。
1、相同再灌注时间下,随着缺血时间的延长,再灌注12 h、24 h、3 d组内,AQP4表达均有逐渐增高的趋势。
2、在相同缺血时间内,随再灌注时间的延长,AQP4表达变化有差异,但在再灌注7 d时AQP4表达均达到相似水平。
讨 论
AQPs是90年代初发现的广泛分布于微生物以及动植物细胞膜上的具有高度选择性的一族跨膜蛋白质。在啮齿类动物的脑组织中,有6种AQPs分布。其中AQP4在脑组织中的含量最高、分布最广,主要表达在脑表面的软脑膜、脑实质的血管周围星形胶质细胞、导水管和脑室系统的室管膜、脉络丛上皮细胞[2-6]。这些部位与脑脊液分泌和重吸收有关的部位一致,提示AQP4起调节水运输的作用,参予脑内水代谢的调节 [4]。
本研究结果显示缺血再灌注各组脑内AQP4表达较假手术组均明显升高,相同再灌注时间下,随缺血时间的延长,AQP4表达均有逐渐增高的趋势。说明随缺血时间延长,AQP4表达增强。Taniguchi 等[7] 研究了大鼠大脑中动脉阻塞后AQP4mRNA的表达情况。结果发现,第1天梗死灶周围皮质AQP4mRNA 的表达上调,第3 天达高峰,第7 天仍处于较高水平,这种变化与MRI 显示的脑水肿形成和消散相一致。急性水中毒性脑水肿模型中显示,AQP4基因敲除大鼠比野生型大鼠更易存活,其神经病理症状及脑水肿程度与正常组相比明显较轻[1,8]。由于AQP4参与了缺血后脑水肿的形成,要防止缺血时间延长导致的AQP4表达增强,缺血时间越短越好,即再灌注越及时越好。
同时,我们发现相同缺血时间内,随再灌注时间的延长,AQP4表达变化有差异。说明缺血时间与再灌注时间存在交互作用。在缺血2 h组内,随再灌注时间的延长AQP4的表达虽略有增高,但增高幅度都不大,而且AQP4表达均低于其它各组。在缺血3 h组内,再灌注各组AQP4表达较为平稳,居于其余两组之间。在缺血6 h组内,AQP4表达水平于再灌注24 h急剧升至最高,AQP4表达急剧升高,说明脑水肿、脑损伤加剧,虽然尔后逐渐降低,但是由此带来的脑损伤可能是不可恢复的。Kawamura等[9]研究大鼠大脑梗死1-5 h后再灌注损伤的变化,结果发现减小脑梗死体积的时间窗以2 h以内再灌注,缺血≥ 3 h足以获得最大的梗死体积,再灌注窗后的任何治疗对缺血再灌注损伤都不会有很好的疗效。局灶性脑缺血的有效治疗时间窗为脑缺血发病后3 h以内,而尚未引发再灌注损伤的再灌注时间窗亦为3 h[10],缺血时间越短进行再灌注,脑内AQP4表达水平越低,而缺血6 h后实施再灌注则会导致AQP4急剧增高。
现有研究表明,AQP4 可能参与和介导了缺血所致的脑水肿的形成。Manley 等[1]在剔除AQP4 基因的小鼠进行脑缺血损伤和水中毒实验,结果显示剔除AQP4 基因后将明显减轻脑水肿的形成和程度。改变脑内AQP4水平或活性可望成为新的防治脑卒中后脑损伤的新策略[11]。充分了解脑缺血再灌注损伤及治疗时间的发展,在适当时期采用适宜的治疗手段,有利于达到理想的治疗效果。
参考文献
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3. Nagelhus EA, Mathiisen TM, Ottersen OP. Aquaporin-4 in the central nervous system: cellular and subcellular distribution and coexpression with KIR4.1.Neuroscience, 2004,129:905-913.
4.石向群,杨金升,张志琳,等.水通道蛋白-4在正常大鼠脑内的分布研究.中华神经医学杂志,2004,4:257-259.
5. Speake T, Freeman LJ, Brown PD.Expression of aquaporin 1 and aquaporin 4 water channels in rat choroid plexus. Biochim Biophys Acta,2003,1609:80-86.
6. Venero JL,Vizuete ML,Machado A,et al.Aquaporins in the central nervous system.Prog Neurobiol,2001,63:321-336.
7. Taniguchi M,Yamashita T,Kumura E,et al. Induction of aquaporin - 4 water channel mRNA after focal cerebral ischemia in rat . Brain Res Mol Brain Res,2000,78:131-137.
8.Verkman AS. Aquaporin water channels and endothelial cell function.J Anat,2002,200 (6):617-623.
9.Kawamura S,Li Y, Shirasawa M, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion in rats using an intraluminal thread technique. Surg Neurol, 1994, 41(5): 368-373.
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11. 石向群,杨金升,王运良.水通道蛋白4基因干预对大鼠脑缺血再灌注损伤后梗死灶体积的影响. 中华老年医学杂志.2005,24(3):201-204.