外周血干细胞(骨髓)移植现状

丽水市人民医院血液科  (供大家学习)

　　PBSCT Periphery blood stem cell transplantation丽水市人民医院血液科方炳木
　　
　　摘要：外周血造血干细胞移植（PBSCT）是造血干细胞移植的一种，又分为自体PBSCT和异基因PBSCT。本文就外周血干细胞/祖细胞的检测方法、常用的动员方法以及自体PBSCT中的净化问题，异基因 PBSCT与异基因骨髓移植的优劣和非血缘PBSCT做一个简要介绍。
　　
　　一、 概要

　　近几十年来，随着临床与实验血液学及相关学科的迅速发展，特别是对造血干细胞特性及造血与调控的深入研究，人们对移植免疫学的深入认识，人类白细胞抗原（HLA）配型技术的进展、血液制品及抗生素等支持疗法的进展、全环境保护治疗的应用特别是血细胞分离机及多种造血细胞生长因子的广泛应用，极大的推动了外周血造血干细胞移植的迅猛发展，现已成为治疗白血病、部分恶性实体瘤等的主要治疗方式之一。

　　目前，造血干细胞移植按造血干细胞来源可分为

　　（1）骨髓移植

　　（2）外周血造血干细胞移植（PBSCT）

　　（3）胎盘/脐带血造血干细胞移植。

　　按移植物免疫学特征可分为

　　（1）自体移植（auto-SCT）

　　（2）异基因移植（allo-SCT）

　　（3）同基因移植（syn-SCT）

　　（4）异种移植（Xeno-SCT）。
　　
　　外周血造血干细胞移植（PBSCT）是造血干细胞移植中的一种，又可分为自体PBSCT（auto- PBSCT）、异基因PBSCT（Allo-PBSCT）。主要通过采集经过动员后的外周血中的造血干/祖细胞作为移植物移植给受者，使其建立起正常的造血与免疫功能，与骨髓一样，采集到的外周血中的血细胞成分包括各类造血祖细胞、各个分化阶段的血细胞及成熟的血细胞。
　　
　　二、 外周血造血干细胞移植历史
　　
　　早在60年代初期，人们在为化疗后的细胞减少患者输注人体的细胞时，偶然发现在输注慢性髓性白血病（CML）患者外周血后出现一过性ph染色体阳性细胞，从而提示外周血中含有造血干细胞。1975年Richman发现化疗后恶性实体肿瘤患者化疗后，外周血中造血细胞集落形成细胞呈一过性增加。1977年Goldman等对CML患者采集未经动员的外周血造血干细胞并冷冻保存，在患者急变后行的外周血造血干细胞移植，开创了外周血造血干细胞移植的先河。1980年Rich为一例严重联合免疫缺陷患者进行异基因外周血造血干细胞移植。80年代后期，随着血细胞分离技术的改进，造血细胞因子（如 G-CSF、GM-CSF)的临床应用，造血干细胞的迅速发展，PBSCT得以迅速发展。我国在 1989年首先开展了auto-PBSCT，1996年成功开展了异基因外周血造血干细胞移植。
　　
　　三、外周血造血干/祖细胞的检测方法
　　
　　采集、输注足够数量的造血干/祖细胞是保证PBSCT成功的重要环节。因此，准确评价采集物中造血干/祖细胞的数量也是PBSCT中的关键问题之一。
　　
　　1、造血细胞体外集落形成单位的测定
　　
　　通过体外半固体培养的方法测定造血干/祖细胞集落形成单位。常用的为粒-单系集落形成单位（CFU-GM，colony forming units-granulocyte-macrophage），目前多采用甲基纤维素法测定。简而言之，将采集到的单个核细胞（MNC）洗净两次，培养细胞数以2X103- 2X104个为宜，在0.8Gv/v甲基纤维培养体系中，加入小牛血清，适合浓度的细胞因子（GM-CSF），也可加入其他细胞因子（如IL-5，IL-6，SCF等）如要培养CFU-mix，可加Epo、Tpo 等，在CO2培养箱中培养14天，计数集落数。通常PBSCT所需CFU-GM数为≥2X105/kg。
　　
　　2、Long-term culture-initiating cells(LTCIC)的测定
　　
　　将采集的MNC与骨髓基质细胞共同培养、培养4到5周，然后再行甲基纤维素法培养，计算出 LTC-IC，LTC-IC是能够检测到最接近造血干细胞的早期祖细胞检测方法。改良的LTC-IC培养方法将培养时间延长8周，可以得到更为接近造血干细胞的祖细胞。由于LTC-IC培养时间长，操作繁琐，目前临床较少作为PBSCT时检测造血干/祖细胞的方法。
　　
　　3、CD34+细胞测定
　　
　　CD34是80年代中期发现的一种细胞表面分子，在未成熟的造血细胞及所有具有造血潜能的集落形成细胞上表达。CD34+细胞在正常人骨髓MNC中约占1-4％，未经动员的外周血MNC中约为0.2％，动员后的外周血MNC中可达1％。临床应用结果证明，输入一定量的CD34+ 细胞，可长期重建造血。同时输入的CD34+细胞数同移植后造血植活速度呈正相关。最近有报道认为CD34-细胞可能更接近造血干细胞，但目前临床上仍采用已被实践证明的 CD34+细胞数作为造血干/祖细胞的测定指数。
　　
　　由于CD34+细胞在骨髓、外周血及脐带血中含量均低、加之影响测定结果的因素较多，如标本制备过程中是直接标记全血，还是MNC，是否洗涤，CD34抗体种类的不同及分析方法差异等均可影响CD34+结果，造成测定结果的准确性和可重复性较差。
　　
　　基于上述原因，国际上已提出几种标准化方案。其中之一是国际血液治疗与移植工程方案（ISHAGE），采用4个参数：CD34-PE、CD45-FITC、SSC和FSC，用累积设门法分析，检测量少， 75000个CD45+细胞及100个CD34+细胞。
　　
　　另一种为三色方案，引用一种称为7-AAD的核酸染料除去死细胞、另外两种荧光分别为CD14- FITC和CD34-PE，同时设同型对照，依据FSC和SSC确定有核细胞。其商品化试剂盒为Procount，该试剂盒不但可测出CD34+细胞占有核细胞的百分比、还可测出CD34+细胞绝对数。北京大学人民医院用Procount检测脐带血和外周血CD34+细胞，可极大减少在处理技术与分析中人为误差，是一种较好的CD34+测定方法。

　　四、外周血造血干细胞的动员
　　
　　在稳定的造血情况下，人外周血中仅有少量造血干/祖细胞存在，不能满足PBSCT的需要，因此，如何增加外周血造血干/祖细胞数量, 即动员出足够数量的造血干/祖细胞，保证PBSCT成功、是PBSCT技术中的重要环节，也是PBSCT有别于骨髓移植之处。
　　
　　常用造血干细胞的动员方法：
　　
　　1、化疗药物
　　
　　骨髓抑制性细胞毒药物化疗后，在骨髓造血功能恢复期，外周血造血干/祖细胞呈一过性增加，此时用血细胞分离机可采集到足够数量的造血干/祖细胞。常用于许多恶性肿瘤性疾病auto- PBSCT的动员。该方法是第一种被临床广泛应用的外周血造血干细胞动员方法。又分为大剂量单一药物和联合用药两种方式。(1)单一药物中以大剂量环磷酰胺为最常用的方法，通常为4- 7g/m2。此外还有大剂量足叶乙甙、阿糖胞苷等；(2)联合化疗，也是一种常用的动员方法。根据不同疾病选择相应的联合化疗方案，如AML患者采用TAD方案（柔红霉素+阿糖胞苷+6-巯鸟嘌呤）；多发性骨髓瘤的CAVB方案（环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松）；淋巴瘤的CHOP方案（环磷酰胺+阿霉素+长春新碱+泼尼松）等。
　　
　　上述方案各有优缺点，如单一药物方法，骨髓抑制强度大易引起因白细胞减少造成的感染、血小板减少引起的出血。同时单一化疗可能不利于原有肿瘤疾病的巩固治疗。联合用药时骨髓抑制的强度不等，有可能动员不出足够数量的造血干/祖细胞、从而造成动员失败。总之，化疗药物动员外周血造血干/祖细胞时，其化疗方案需达到足够强的骨髓抑制程度，才可保证动员的成功；而对于那些接受过反复多次化疗或其他因素所致的骨髓功能衰竭者，往往动员不出足够数量的PBSC。此外，该方法动员效率不高、常需分离3-4次，且本身副作用较大，目前临床上还很少使用。

　　2、造血细胞刺激因子

　　80年代以来，人们发现许多造血细胞刺激因子，包括集落刺激因子（如G-CSF，GM-CSF，M- CSF）及IL-3、IL-6、IL-8、SCF等，具有更强的PBSC动员作用，具有毒副作用低、动员效率高的特点, 是目前临床上不可缺少的动员方法，主要用于Allo-PBSCT对健康供者的动员及部分恶性肿瘤患者。

　　常用的动员剂为G-CSF，在健康供者动员中, 以剂量5-16ng/kg的G-CSF, 连续供给5-6天, 采集 l-3次、即可采集到足够数量的PBSC。此外, 单独应用GM-CSF或G-CSF、GM-CSF联合也有临床应用的报道，以G-CSF动员方法最为常用。

　　3、化疗联合造血细胞刺激因子

　　该方法是前述两种方法的结合，是目前临床上Auto-PBSCT治疗恶性肿瘤患者最为常用的动员方法。其优点在于既可通过化疗药物进一步杀灭体内残存肿瘤细胞, 又可动员出更多数量的PBSC, 特别是采用增加环磷酰胺剂量的CHOP方案联合G-CSF的动员方法，已成为动员淋巴瘤患者PBSC的最为常用的方法。

　　五、Auto-PBSCT

　　Auto-PBSCT的原理与自体骨髓移植相同，其实质是大剂量化疗杀灭体内的肿瘤细胞，同时也将骨髓造血系统摧毁，再将大剂量化疗前采集的PBSC回输给患者本人。Auto-PBSCT的PBSC来源于患者本人，不受HLA配型相和供者的限制，移植后无GVHD等并发症。因此移植相关死亡率远低于Allo- PBSCT，小于10％，目前主要适用于对放/化疗敏感的恶性肿瘤患者。如淋巴瘤、急性白血病、部分恶性实体肿瘤（乳腺癌、卵巢癌、肝癌、神经母细胞瘤），此外非恶性疾病、严重自体免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等。据IBMTR统计，在接受Auto-PBSCT治疗病种，淋巴瘤占第一位，其次是急性白血病。

　　Auto-PBSCT与自体骨髓移植相比，具有如下优点：（1）采集比较方便，采集PBSC时无需麻醉，也无需多部位穿刺骨髓抽髓引起的痛苦。（2）对于部分侵犯骨髓的患者和多发性骨髓瘤的患者，由于骨质破坏或肿瘤细胞浸润骨髓，及骨盆局部放疗等原因无法采集骨髓时，可采集PBSC。（3）移植后造血功能恢复快，移植后感染、出血等并发症少，减少了抗生素和成分输血的应用，降低了移植相关死亡率。缩短了住院时间，节减了费用。（4）与骨髓相比，外周血中肿瘤细胞混入的少。有资料显示，对多发性骨髓瘤、淋巴瘤及一些实体肿瘤患者采集的PBSC中检测结果表明：虽然采集的PBSC中并不能完全避免肿瘤细胞的污染，但其检出率低于骨髓。最初人们曾设想PBSC中肿瘤污染少，Auto-PBSCT可降低复发率。但现有资料表明Auto-PBSCT后的复发率并不比自体骨髓移植少。

　　Auto-PBSCT的最大问题是移植后复发率高，是导致移植失败的最主要原因。因此，如何降低移植后复发率，是提高Auto-PBSCT长期生存率的关键所在。除了加强移植前的化疗以减轻肿瘤负荷，改进预处理方案，以便最大限度地杀灭体内残存的肿瘤细胞，及体内净化外，对移植物的体外净化进行了大量研究工作。体外净化的方法包括阳性选择和阴性选择，前者是筛选出造血干/祖细胞，也就是CD34+细胞选择,后者为去除采集物中的肿瘤细胞。
　　
　　目前研究的方法较多，但临床应用的方法较少。

　　1、物理学方法：
　　
　　根据肿瘤细胞和正常造血细胞之间的大小、密度、对温度的敏感性等物理学特性达到净化的目的，包括密度梯度离心、冷冻、淘洗、高温等方法。由于净化效果不佳，现已较少采用。近来采用光敏剂（MC-450）可杀灭肿瘤细胞4-5个对教级，对正常造血细胞杀伤少，是一种有前途的净化方法。

　　2、药物：

　　利用某些药物对肿瘤细胞和正常造血干细胞的杀伤存在较大差异的特点，如4-羟环磷酰胺（4-HC）等，有作者比较了经4-HC净化与非净化自体骨髓移植治疗急性髓性白血病的疗效，前者实际无病生存率为51％；后者仅为32％。此外，EBMTR报道了经磺乙硫环磷酰胺（Mafostamide, MFD）净化自体移植治疗淋巴瘤疗效优于未净化的自体移植。为减少净化药物对正常造血细胞的影响，人们尝试应用细胞保护剂配合细胞净化。如Amifoscine是一种磷酸化氨基脂类原药，经碱性磷酸酶磷酸化后生成活性代谢产物，它能够选择在正常细胞中聚集，增加4-HC或MFD对肿瘤细胞的毒性，采用上述方法配合净化，移植后可缩短造血恢复的时间。其他用于净化的药物还有足叶乙甙、维拉呱咪等。

　　3、免疫学方法：

　　是目前研究的重点之一，它是采用针对肿瘤细胞与正常造血细胞表面抗原的差异，将肿瘤细胞特异性抗体选择性结合在肿瘤细胞上，加以清除。常用的有（1）补体依赖的细胞毒法：单抗与相应靶细胞结合后再加入补体，通过激活补体经典途径使靶细胞溶解破坏，达到净化目的。有文献报道，采用多种B细胞单抗（CD9、CD10、CD19、CD20）或T细胞抗体（CD2、CD3、CD4、CD5等）联合补体体外净化骨髓治疗急性淋巴细胞性白血病，3年DFS为41％，未净化组为26％。此外，有作者应用 AML-223（抗CD14单抗）加免疫补体净化治疗急性髓性白血病，取得了与Allo-骨髓移植相似的疗效。（2）免疫毒素介导的细胞毒法，此法是将特异性抗体与细胞毒素（蓖麻毒素）结合制成免疫毒素，即有强大的杀灭肿瘤效应，又有特异性。（3）免疫物理法，用单抗包被微球体或金属颗粒，标记靶细胞后使细胞密度增加或产生磁性、再通过沉淀或磁场吸附方法清除靶细胞。上述方法各有利弊，目前临床上主要用于淋巴细胞性疾病的净化。

　　4、CD34+细胞选择法：

　　除部分造血系统恶性肿瘤外，其他绝大部分恶性肿瘤不表达CD34抗原。

　　通过选择CD34+细胞达到去除肿瘤细胞的目的。现已成为一种新的较有前途的体外净化方法，常用的有亲和柱层析，分离和免疫磁珠法。通过特异性识别、俘获及洗脱分离得到 CD34+细胞。（1）亲和柱层析是将预分选的采集物生物素化（biotinglated）的抗 CD34抗原的单抗一起孵育，然后洗去未结合的抗体，通过抗生物素蛋白包被的聚丙酰胺柱的亲和柱，使CD34+细胞留滞在柱内的聚丙酰胺表面上，再经机械摇动，冲洗出 CD34+细胞。Cellpro公司生产的CD34+细胞分选仪就是基于这种原理设计的，现已应用于临床不但可以做自体净化，亦可在Allo-PBSCT中去除T细胞。（2）免疫磁珠分离法：将 CD34单抗标记细胞后，直接或间接与超顺磁性微球连接、通过强磁场中的过滤柱时，阳性细胞被吸附，阴性细胞被滤掉。近来，为克服原来磁性微球大的缺点(直径45um)，研制出了纳米微粒作为固相收集CD34+细胞。通过将采集物与抗CD34抗原的单抗结合，细胞特异地被超顺磁铁－葡聚糖纳米（直径50nm）微球结合，使CD34+细胞与纳米微球形成复合物，再通过一个永久磁铁诱导的强磁场过滤柱，分离出CD34+细胞。Amgen公司研制的 CliniMACS系统就是这种应用于临床的装置，其CD34+细胞回收纯度＞95％, 回收率67% 以上。

　　六、Allo-PBSCT

　　自1989年Allo-PBSCT治疗急性淋巴细胞性白血病获得成功以来,因其具有采集外周的造血干细胞无需麻醉、简单易行、移植后造血功能恢复迅速等优点，日益受到人们的重视。虽然Allo-PBSCT具有上述优点，但在目前尚不能取代Allo-BMT。我国于1995年成功进行Allo-PBSCT。

　　1、健康供者外周血的造血干细胞动员与安全性

　　对健康供者的PBSC动员常用剂量为10ug/kg/天，虽然CD34+细胞的动员效率与G- CSF剂量有关，但超过10ug/kg/天并不能使得CD34+细胞增加很高。目前欧洲造血干细胞移植协作组（EBMT）和美国国家供者计划（NMDP）都建议G-CSF用量为10ug/kg/天。通常G-CSF给药4-6天，CD34+细胞在第5或第6天达峰值(peak)，第7天以后，CD34+细胞有下降的趋势。因此，目前多在第4-6天之间采集1-2次。目标采集量一般为4- 5X106/kg，也有1X106/kg可以植活的报道。

　　关于健康供者的安全性，有两方面的内容：（1）G-CSF对健康供者的安全性；(2)采集时的安全性。G-CSF的安全性分为近期和远期两类。近期副作用最常见为骨痛，其他有发热、头痛、恶心、呕吐、全身不适等。一般停药后可迅速消失。血生化检查可有碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶轻度升高，钠、镁离子轻度降低，停药后均可恢复。血象中除有白细胞增高外；常有血小板减少，其原因与采集有关。但也有未行采集即可出现血小板减少。同时G-CSF可引起血小板聚集功能亢进，并有引起心肌梗塞、脑血管病的报道。关于G-CSF的远期副作用，目前尚不清楚，需要大量病例长期随访10年才能得出结论。有个别报道非肿瘤性疾病患者，长期使用G-CSF后出现染色体异常、出现骨髓增生异常综合征（MDS）的报道。亦有健康供者5年后出现染色体异常的报道。但美国西雅图报告随访观察3-6年, 未发现G-CSF的副作用。PBSC采集的副作用主要有ACD-A大量使用时所致的ACD中毒引起低钙，出现恶心、呕吐、手足抽搐等，可用钙剂拮抗。如需大量采集时，可联合肝素以减少 ACD-A的用量。

　　2、Allo-PBSCT后的GVL效果

　　Allo-PBSCT与Allo-BMT相比具有以下特点:（l）输入的CD34+细胞数远多于骨髓，（2）T细胞数亦高于骨髓10-20倍，(3)经G-CSF动员后输入的T、单核细胞特性不同于未经G-CSF动员的骨髓中的T细胞和单核细胞。

　　Allo-PBSCT输入大量T细胞的结果，使得由淋巴细胞介导的免疫功能得以迅速恢复。曾有人担心输入大量T细胞会导致急性GVHD发生率与严重程度加重，但事实上与Allo-BMT相似。另一方面，慢性 GVHD的发生率有所增加。有作者认为慢性GVHD与GVL密切相关。西雅图研究小组进行了Allo-BMT与 PBSCT的随机对比研究，认为BMT较PBSCT复发率高，其中高危组PBSCT复发率低于BMT。英国的研究结果也支持这种观点。但法国的研究结果认为两者之间无显著性差异。以上结果表明，至少在高危组、Allo-PBSCT的复发率低于Allo-BMT。

　　3、非血缘关系PBSCT（UPBSCT）现状

　　自70年代后期开展非血缘关系BMT（UBMT）以来，现全世界已有超过500万人在世界各地的非血缘关案骨髓资料库中登记。近年来采用G-CSF动员PBSC进行UPBSCT的病例数亦在逐年增加。UPBSCT 开始是用于第一次UBMT后复发或排斥的患者，进行第二次移植，现在第一次移植也选用UPBSCT。与 UBMT相比较，UPBSCT时：（1）PBSCT时输入的CD34+细胞数较多，移植后造血功能恢复迅速，特别是血小板恢复迅速；（2）急性GVHD的发生率与严重程度两者相似。但UPBSCT的慢性 GVHD的发生率增加。此外，造血的迅速恢复可降低移植相关死亡率。由于UPBSCT后慢性GVHD增加，相应地GVL也增强，有可能提高一些疾病晚期患者移植后的生存率。