生精细胞培养进展

王怀秀综述

山西省人民医院不孕不育科（太原 030012）

人类对生殖系统的认识以及辅助生殖技术的发展经历了一个漫长的过程。1677年，Leeuwenhock使用自制的显微镜在输精管内发现了精子。1784年，Spallanzani用人工授精的方法使狗获得妊娠。1785年，苏格兰外科医生John Hunter在人类尝试人工授精，并在同年获得成功。1964年，Yanagimachi 和Chang在体外条件下使金黄地鼠卵子获得受精。1969年，Edward等开始研究人类体外受精技术。1976年，Steptoe 和 Edwards应用体外受精-胚胎移植技术在人类获得妊娠成功，但是，植入的胚胎着床于子宫外，未能获得活产婴儿。1978年，Steptoe 和 Edwards应用体外受精-胚胎移植技术获得世界上第一例活产婴儿。1991年，Gianpiero Palermo发明了卵子胞浆内单精子显微注射技术。该技术的问世，使得精液中无精子，只有在睾丸或附睾内能找到精子的患者也获得了生育机会。但是，对不仅精液中无精子，而且睾丸以及附睾中也找不到精子的患者却成为男性不育的难题。精子来源于睾丸生精小管中的生精细胞，而绝大多数无精子症是由于生精细胞分化以及成熟障碍。因此，近年来，人类在辅助生殖技术取得长足进展的基础上又开始了旨在将生精细胞培养成为精子或精子细胞的研究。山西省人民医院生殖遗传科王怀秀

一、生精细胞与支持细胞

精子是由精原细胞经过初级精母细胞、次级精母细胞、精细胞几个中间阶段而形成的。从初级精母细胞到精细胞阶段，发生了两次减数分裂，染色体由二倍体变为单倍体。然后，精细胞经历Sa、Sb、Sc和Sd四个阶段，细胞形态发生明显变化，原来的圆形细胞形成顶体和尾巴，具有了运动能力和受精能力。上述精子发生过程中形成精子前的细胞统称为生精细胞。

在生理情况下，上述精子形成要在支持细胞存在的情况下才能完成。支持细胞是生精小管中的基本细胞。有的无精子症患者生精小管中只有支持细胞，没有任何生精细胞（唯支持细胞综合征），但至今为止尚未见生精小管中有生精细胞而无支持细胞的报道。

二、生精细胞培养

1995年，Fishel首次报道了用Sd精细胞体外受精获得妊娠^（1）。此后，不少学者利用Sd精子细胞体外受精也获得妊娠。这些研究表明，没有完成变态的精细胞也具有受精能力。其后，又有学者尝试应用圆形精细胞（Sa精细胞）进行体外受精获得妊娠^（2、3）。但是 ，Sa精细胞的体外受精率、妊娠率以及活产率显著低于利用Sd精细胞的结果^（4）。Balaban等对睾丸内精子以及Sa精细胞的体外受精能力进行对照研究, 发现两组的受精率分别为73.5%和50%,优质囊胚形成率分别为53%和25%，孵化率分别为31.2%和0%。受精后第5～6d，由睾丸内精子受精的受精卵均发育成为囊胚，由Sa精细胞受精的受精卵只有25%发育成为囊胚⁽⁵⁾。Tesarik 等研究发现，虽然Sa精细胞与精子以及Sd精细胞都是单倍体，含有等量的DNA，但是，在生精细胞完成减数分裂后的成熟过程中，其DNA的组织形式经历了重要变化。比如，Sa精细胞DNA之间的蛋白为组蛋白，而在Sd精细胞以及精子中DNA之间的蛋白为鱼精蛋白。DNA链之间为组蛋白的精细胞细胞核致密化程度低，DNA容易被核酸酶以及其它因素所损伤。因此，以Sa精细胞进行体外受精时，受精率、胚胎形成率、囊胚孵化率、妊娠率以及活产率均显著低于相对成熟的精细胞以及精子⁽⁶⁾。

为了使精子细胞更加成熟，从而提高其受精能力，一些学者对生精细胞进行体外培养研究。

具体培养方法有细胞培养和组织培养两种。

1、细胞培养  细胞培养是将生精小管内的生精细胞以及支持细胞分离出来进行培养，分离细胞的方式有机械法^（7）和酶消化法^（8）两种。这种方法可用于研究调控生精细胞减数分裂以及精子成熟的有关因素。

国外学者对精原干细胞培养进行过研究。根据文献，精原干细胞只能在体外培养中短暂成活，尚未见精原细胞在体外培养中发生精子分化的报道。而且，体外培养精原干细胞需要有饲细胞层，通常应用的饲细胞种类有STO、MEF、人胚胎成纤维细胞以及支持细胞等⁽⁹⁾。

由于制作饲细胞层比较繁琐，而且应用异体或异种饲细胞可能对生精细胞造成污染，有人通过在培养液中添加生精过程中相关激素进行生精细胞培养。刘锋等取14例无精子症患者的支持细胞、生精细胞在含促卵泡刺激素（FSH）和睾酮（T）的培养液中进行体外培养，约有22%的圆形生精细胞变长，出现鞭毛生长。用长形精子细胞对患者捐献的10个成熟卵子进行卵胞浆内单精子显微注射，14h后有3个卵子出现了明显的雌雄原核，16h后分裂为4细胞，72h后分裂为16细胞^（10）。Sousa等将经体外培养形成的长型精子进行卵子胞浆内单精子显微注射，受精率可达31.0%～38.0%，且可发育到囊胚^（11）。

2、组织培养  早期的研究采取组织培养方法，即取部分睾丸组织或生精小管在体外进行培养。这种培养方法基本上保留了生精小管原有的结构以及生殖细胞与支持细胞之间的立体关系。在这种接近生理状态的微环境中，生精细胞能生存较长时间，初级精母细胞以很快的速度进行减数分裂，形成精子细胞^（12）。

    张岩等将大鼠含支持细胞和生精细胞的生精小管组织块在含10%胎牛血清的培养液中进行培养，虽然在培养液中没有添加任何细胞因子和生长因子，共培养的的支持细胞和生精细胞在体外存活超过6个月，而且生精细胞不断产生精子细胞。该试验提示组织块可为生精细胞的增生和分化提供必要的细胞因子^（13）。Angelopoulos等报道，组织培养方法还可使睾丸组织中的精子活力增强，其效果与经过己酮可可碱和a-脱氧腺苷孵育相似^（14）。但是正因为保留了原有的生精小管结构，这种方法不能明确精子发生所需的条件以及睾丸中生精细胞与支持细胞之间的相互关系。

3、培养系统  在体外培养研究中，不同的研究者采用不同的培养液，文献报道的培养液有Ham’s F-10、Gamete 100、DMEM等。研究结果表明，生精细胞的分化以及精细胞的成熟需要支持细胞的作用。如果在培养系统中没有支持细胞，培养的生精细胞以及精细胞容易发生凋亡^（15）。在培养液中添加FSH,可以启动精母细胞的减数分裂。此外，FSH还能促进精细胞细胞核的致密化以及细胞浆的成熟。FSH的以上作用是通过支持细胞介导的^（14）。单独应用T对精子分化以及成熟无明显效果，当与FSH合并使用时对生精细胞的减数分裂以及精子变态有促进作用。睾酮的这一作用是通过防止支持细胞凋亡而实现的^（15）。

但是，由于无精子症患者的发病原因各不相同，生精细胞培养所需FSH以及T的浓度也有差别。研究发现，在阻塞性无精子症患者，应用FSH 50IU/L，T 1µmol/l的浓度可以获得生精细胞分化以及精细胞变态。在部分非阻塞性无精子症患者，应用以上浓度则不能取得预期效果。体外培养不理想的患者往往血清FSH较高，提示这些患者的支持细胞FSH受体存在缺陷或者对FSH敏感度低下。Tesarik等对19例生精细胞成熟阻滞的患者应用含FSH 500IU/L，T 10µmol/L的培养液进行体外培养，结果使部分阻滞于Sa精细胞阶段患者的精细胞发育到Sd精子细胞。在某些患者，甚至使阻滞于第一次减数分裂粗线期的生精细胞发育到Sd精子细胞。有5例患者应用该生精细胞体外培养技术获得健康婴儿^（16）。

有学者对睾丸组织中的精子应用不含FSH、T以及含FSH、T的两种培养液进行体外培养，结果发现，含FSH、T的培养系统可以获得较高的精子活率，较高的受精率、着床率以及临床妊娠率。进一步，对精液中的圆形细胞应用不含FSH、T以及含FSH、T的两种培养液进行体外培养，虽然在两种培养系统中圆形精细胞的形态均没有发生变化，但含FSH、T培养系统中的圆形精细胞受精率较对照组显著提高^（12）。

由于人的体温为37^。C，一般人体细胞的培养温度在37^。C。对生精细胞采取37^。C培养，精原干细胞虽然可以较早贴壁和增殖，但存活时间短。考虑到睾丸的适宜温度较体温低2～3^.C^。，许多学者在32^.C下进行生精细胞培养^{（14、17)）}。有学者用小鼠对生精细胞培养的适宜温度进行研究，结果表明，在34^。C、30^.C温度下精原干细胞可以维持较长的存活时间和增殖时间^（18）。

以上研究表明，含有支持细胞以及适宜浓度FSH、T的培养系统可以促进生精细胞分化以及精细胞的变态，有可能使无精子症的患者实现生育。含FSH、T的培养系统可以提高精细胞以及精子的受精率。因此，男性生殖细胞的体外培养成为男性不育研究领域的一个新课题和热门课题。

三、问题及展望

近年来，虽然在生精细胞体外培养方面取得长足进展，但是，生精细胞在体外培养过程中寿命很短。Aslam等报道，体外培养24h之内，生精细胞逐渐失去活力，体外培养72h，约90%细胞死亡^（19）。另外，通过体外培养形成的Sd精细胞部分形态异常^（15），这可能与体外培养过程中生精细胞分化大大加速以及培养液中的成分尚未达到优化有关。因此，改善培养条件以延长生精细胞在体外培养中的寿命，以及进一步探讨生精细胞分化所需的条件成为未来生精细胞培养的课题。

    关键词：生精细胞；  细胞培养； 无精子症

 

 

参考文献

1、Fishel S,Green S,Bishop M et al    Lancet 1995;345:1641-1642

2、Vanderzwalmen P, Zech H, Bikenfeld A et  al   Hum Reprod  1999;14:2796-2800

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4、Al-Hasani S,Luduig M,Palermo I et al     Hum Reprod  1999;14(suppl 1):97-107

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10、刘锋、邹彦、邓志华等 中国男科学杂志 2006；20（3）：32-37

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