乙肝肝硬化失代偿期辅以自体骨髓干细胞移植治疗41例临床分析

刘黎 周健 李多云 黄丽雯

武汉科技大学附属天佑医院感染科（湖北 武汉，430064  ）

 

摘要 目的：观察经肝动脉行自体骨髓干细胞移植对乙肝肝硬化失代偿期患者的治疗效果。方法：选择乙肝肝硬化失代偿期患者41例，抽取自体骨髓200ml，在体外分离纯化骨髓干细胞制成10ml细胞悬液，经肝动脉介入方法移植入肝脏,分别在移植后第2、4、8周复查肝脏功能，观察实验室指标、临床症状及不良反应情况。结果：移植后第4周和第8周，血清学指标如谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB)、总胆红素(TBIL)、凝血酶原时间(PT)、胆碱酯酶(CHE)及甲胎蛋白(AFP)较术前均有明显增高或降低(P<0.05);自体骨髓干细胞移植对乙肝肝硬化失代偿期患者生存质量的影响：胸水减少6例;腹水减少13例;下肢浮肿减轻9例;食欲改善12例,乏力好转17例;腹胀减轻16例。41例患者术中未发生严重并发症，近期无不良反应出现，有4例治疗3个月后因肝硬化并发症死亡。结论：自体骨髓干细胞移植治疗可使乙肝肝硬化失代偿期患者肝功能明显改善,治疗安全有效且副作用小,可作为中晚期肝硬化患者的临床治疗方案。武汉科技大学附属天佑医院感染科刘黎

[关键词]自体骨髓干细胞；移植；肝硬化

Transplantation of autologous bone marrow stem cells via hepatic artery for 20 patients with decompensated cirrhosis

各种原因引起的肝硬化是临床常见病、多发病,该病进入失代偿期后逐渐发展,最终可能导致肝功能衰竭。在治疗上一直以来并没有令人满意的进展,临床上主要仍以保肝对症及预防并发症为主,总体治疗效果不满意, 尤其是终末期肝硬化的治疗总体效果更差。近年来原位肝移植已成为终末期肝硬化最理想的治疗选择,但由于供体肝脏的紧缺,移植后的免疫排斥反应以及高额的医疗费用等限制了其临床应用。干细胞定向分化为功能细胞并且应用于器官损伤的治疗,是目前细胞生物学以及生命科学的研究热点^[1-2]。研究表明,在肝损伤及肝细胞再生的过程中^[3],干细胞起着重要的作用,而骨髓干细胞是肝细胞的重要的肝外来源^[4-6]。骨髓干细胞在特定环境下可分化成肝干细胞及肝细胞,从而参与肝结构和功能的修复和重构^[7]。基于此,笔者应用自体骨髓干细胞移植治疗乙肝肝硬化失代偿期患者41例，取得一定疗效，现报道如下。　

1 资料与方法

1.1临床资料  41例乙肝肝硬化失代偿期患者均为2009年4月至2010年3月在本院感染科住院病人,诊断符合2000年9月中华医学会修订的《病毒性肝炎肝硬化诊断标准》^[8]。其中女性8例,男性33例；年龄27-72岁,平均年龄49.4岁,均确诊为乙肝肝硬化失代偿期,根据肝硬化Child ?Pugh计分及评级标准分级为：B级24,C级17例。

1.2 治疗方法

1.2.1术前准备 患者入院后均行内科对症治疗,包括保肝、利尿及必要时腹水超滤回输等,所有治疗措施在患者知情同意情况下进行,签署《知情同意书》。移植前连续2d给予患者集落细胞刺激因子100mg皮下注射;术前1d行碘过敏实验,双侧腹股沟备皮,移植当日对患者进行隔离,骨髓穿刺术前5-10h进行房间消毒。

1.2.2骨髓干细胞采集及分离 取患者两侧髂后上棘为穿刺点,局部麻醉消毒,在无菌条件下,以18号骨髓穿刺针穿刺,抽取骨髓200ml,以7500U肝素抗凝,然后在本院干细胞实验室采用密度离心法进行骨髓干细胞的体外分离及纯化,得到细胞计数为3.2×10⁹/ml-1.6×10¹⁰/ml。

1.2.3骨髓干细胞移植 在DSA下经股动脉穿刺插管,置管于肝固有动脉进行造影,观察肝内血管情况及有无占位性病变。将待用的细胞悬液10ml于0.5h内经左右肝动脉缓慢注入;术毕拔管,穿刺点加压包扎后返回病房,穿刺侧下肢制动24h。

1.3疗效观察

1.3.1血清生化指标检测 所有患者分别于术前、术后2周、4周、8周进行血清生化指标检查，包括谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、白蛋白(ALB) 、总胆红素(TBIL)、凝血酶原时间(PT)、胆碱酯酶(CHE)及 甲胎蛋白（AFP）等。

1.3.2临床一般情况及不良反应观察 观察患者治疗前后的腹水、胸水、下肢浮肿、腹胀、体力、食欲等变化及不良反应情况，同时进行影像学检查。

1.3.3临床综合疗效判断标准 根据临床症状、体征和实验室检查结果,将临床综合疗效分为：①显效：临床主要症状、体征（如腹胀、浮肿、乏力、纳差等）消失，影像学检查提示胸、腹水消失，ALB＞35g/L；②有效：临床症状、体征消失或明显改善,实验室检查指标好转；③无效：临床症状和体征没有改善或加重，实验室检查指标无好转甚至恶化。

1.4统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计，数据以均数±标准差( ±s)表示,组间比较用t检验,P<0.05,表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清生化指标变化   患者在干细胞移植后第2周实验室指标开始出现变化,至第4周多项指标出现显著变化(见表1),其中ALT、AST均较术前降低明显(P<0.05),ALB较术前显著升高(P<0.05）；TBIL较术前也有所降低,但无统计学意义(P>0.05);PT和AFP较术前明显下降(P<0.05）；CHE较术前有升高,但统计学无意义(P>0.05)。至第8周时, TBIL和CHE较术前明显减少和增高(P<0.05)。

表1  自体骨髓干细胞移植前后患者血清学指标变化情况( ±s，n=41)

组  别	ALT  (U/L)	AST (U/L)	ALB (g/L)	TBIL (umol/L)	PT (s)	CHE (U/L)	AFP (ng/ml)
术前 术后2周 术后4周 术后8周	67.5±13.2 43.3±10.6* 34.7±15.0* 36.2±14.2*	70.3±18.7 50.3±12.4* 47.7±14.6* 46.3±14.5*	31.6±4.1 32.3±2.8 35.2±3.0* 35.3±2.9*	61.3±19.7 55.3±13.0 57.4±14.9 41.7±12.6*#	23.7±4.8 22.1±3.8 19.1±3.2* 18.2±2.5*	75.5±21.3 76.4±15.3 79.5±14.8 95.±12.1*#	11.7±5.2 13.6±7.3 24.2±7.9* 25.3±8.3*

注：与术前比较,*P<0.05;与术前4周比较,#P<0.05。

2.2 临床症状及体征  自体骨髓干细胞移植后第8周时大多数患者临床症状,体征明显改善，其中胸水减少6例;腹水减少13例;下肢浮肿减轻9例;食欲改善12例,乏力好转17例;腹胀减轻16例,见表2。

 

 

 

 

 

表2自体骨髓干细胞移植前后患者临床症状及体征变化

组别	例数	胸水	腹水	下肢浮肿	腹胀	乏力	纳差
手术前 手术后	41 41	12 6	22 9	19 10	29 13	35 18	31 19

2.3临床综合疗效  术后第8周,本组41例患者中临床综合疗效观察表明,显效17例,有效14例,无效10例,临床总有效率为75.6%。Child?Pugh计分,治疗前为(10.3±2.1),治疗后为(8.5±1.9),两者比较有统计学意义(P<0.05）。

2.4不良反应  41例自体骨髓干细胞移植患者术中及术后未发现严重不良反应及并发症。术后低热3例,24小时内自行缓解；介入伤口渗血2例,经止血药物治疗后好转;无感染、肝区疼痛等并发症发生。有4例患者术后3个月因肝硬化并发症死亡，（其中2例死于消化道大出血；2例死于肝肾综合症）。

3  讨 论

肝硬化为临床常见病,一直以来缺乏有效的治疗手段。原位肝移植是目前比较根本有效的治疗方法,但受限于供体肝的缺乏、移植后的免疫排斥反应及高额治疗费用而难以普遍开展，肝细胞移植和人工肝支持系统作为原位肝移植的替代治疗,同样存在上述问题。干细胞移植是当今世界上最前沿、最热门的医疗新技术之一。最近，俄罗斯、英国等先后应用自体骨髓干细胞移植技术在治疗终末期肝病方面获得满意效果,引起了世界范围内的关注。被誉为“肝硬化治疗第二条终极途径”。

干细胞是一类具有自我更新和分化能力的细胞,在一定的环境下可分化为多种功能细胞,用于治疗肝硬化的干细胞根据其起源的不同,可分为肝源性肝干细胞和非肝源性肝干细胞,后者包括骨髓源性干细胞、胰腺上皮细胞及神经干细胞等,其中骨髓源性干细胞又包括造血干细胞、间充质干细胞及骨髓干细胞,不同来源的肝干细胞虽然在形态、表面标志、功能及分化等诸方面有所差异,但均具有多向性演变的特性^[9]。

目前许多研究表明骨髓干细胞具有向一些成体细胞(例如神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞及肝细胞等)分化的潜能^[10-11]。大量研究也显示，在人肝硬化进展期过程中，肝细胞因端粒缩短导致肝细胞复制活动消失，此时产生于骨髓造血干细胞的卵圆细胞是肝细胞再生的主要来源，人的肝细胞和胆管细胞可由骨髓干细胞迁移并分化生成，如此可补充大量的肝细胞和胆管细胞^[12-13]。骨髓源性干细胞诱导产生肝细胞的机制包括通过细胞融合的方式产生四倍体、六倍体和非整倍体肝细胞；另外,骨髓造血干细胞还可能通过启动快速高效的内源性肝细胞的增殖途径,进而改善内源性肝细胞的损伤。大量研究表明,骨髓源性干细胞经诱导后产生的肝细胞是可以很好地替代受损肝细胞,进而恢复肝脏的功能。

为探讨骨髓源性干细胞对乙肝肝硬化病人的治疗作用，我们在临床上开展了自体骨髓源性干细胞经肝动脉移植治疗失代偿期乙肝肝硬化的研究。本研究发现，自移植后第 2 周实验室指标出现变化;至移植后第4 周，患者血清白蛋白水平均明显升高(P<0.05）;AFP和凝血酶原时间均较术前显著改善(P<0.05）；ALT、AST于术后第4周亦出现下降,程度明显(P<0.05）。然而，血清总胆红素水平虽有下降,胆碱酯酶虽有上升,但均无统计学意义(P>0.05）;至移植后第8周, TBIL和CHE较术前均明显减少和增高(P<0.05)。上述结果表明，骨髓干细胞移植治疗后，患者肝脏功能明显改善，尤其以肝脏的合成及修复功能改善为显著,这些变化特别是血清白蛋白的升高是一般护肝治疗不可能达到的。此外，我们还观察到移植后大多数患者的临床症状明显改善,移植后第8周时胸水消失6例;腹水消失13例;下肢浮肿减轻9例;食欲改善12例,乏力好转17例;腹胀减轻16例。临床综合疗效观察结果也表明,显效17例,有效14例,无效10例,临床总有效率为75.6%。Child?Pugh计分,治疗前为(10.3±2.1),治疗后为(8.5±1.9),两者比较有统计学意义(P<0.05）。41例移植患者术中术后均无严重不良反应及并发症发生,虽然术后3月有4例病人出现死亡,但死亡原因均为原有基础疾病较严重所致。

国内外的研究及临床应用均表明,自体骨髓干细胞移植治疗肝硬化效果显著^[13-16],具有广泛推广价值,综合起来,主要有四大优点：①骨髓干细胞移植则来源方便，不受供体缺乏的限制，还可免除免疫排斥反应的发生^[16]；②效果明显：2-4周，食欲不振、乏力、腹水等症状显著减轻甚至消失；8-12周,干细胞开始分化,8项关键性生化指标可望恢复；3-6个月,随着新的肝细胞不断增加,受损肝组织得到修复,肝功能逐渐恢复,患者体征可获全面改善,步入康复阶段；③费用低廉：一般国内实施自体干细胞移植的费用平均在3-5万元,和活体肝移植相比,仅相当于其费用的1/10左右,而实质性改善状况尤其是远期效果并无特别差异；④技术风险小：手术本身过程并不复杂,加上采用的是介入微创手段,而且移植对象来自于患者本人,所以不会产生肝移植那样的排异反应。身体条件好些的,做完后观察数日即可出院。

我国是肝病尤其是病毒性肝炎的高发区，各种原因导致的肝硬化患者众多，在药物及原位肝移植治疗之外，自体骨髓源性干细胞移植治疗失代偿期肝硬化是一种全新而有效的新方法，其虽不能给肝病患者带来治愈性的效果，但可在很大程度上控制肝硬化的进展速度，提高肝硬化患者的生存质量。我们在本研究中采用的干细胞类型、选择的移植途径、使用的细胞数量均已在临床应用中得到有效证实，但仍有许多问题需要研究和思考，如骨髓源性干细胞中是否须进一步鉴别及纯化；分离纯化后的干细胞如果经过体外扩增后能否进一步提高疗效；干细胞经肝动脉途径移植与经门静脉途径、经脾途径、 经外周静脉途径及肝组织局部注射途径移植的优势对比；干细胞的数量及移植手术次数对临床疗效果有何影响，此外本项研究例数尚少，需要进一步增加病例数，这些都是我们下一步研究中需要进一步观察和解决的问题。

 

参考文献

1.       Yao Peng.Activation of NF-KB is not essential for hepatocyte growth factor mediated antiapoptosiseffect on WB F-344 cell but for WB cell proliferation [J]. Hepatology, 2004,40:391-398.

2.       Kusheda T,Inaba M,Hisha H,et al.Crucial role of donor-derived stromal cells in successful treat ment for intractable autoimmune diseases in MRL/lprmice by BMS via portal vein[J].Stem Cell,2001,19:226-235.

3.       姚鹏.细胞因子在体外对大鼠肝干细胞的影响[J].中华肝脏病杂志,2003,11(1):33-36.

4.       Peterseb BE,Bowen WC,Patrene KD,et al.Bone marrow as a potential source if hepatic oval cells[J].Science,1999,284:1168-1170.

5.       Oh SH,Miyazaki M,Kouchi H,et al.Hepatocyte growth factor induces differentiation of adult rat bone marrow cells into a hepatocyte lineage in vitro[J].Biochem Biophys Res Commu,2000,279:500-504.

6.       Cantz T,Sharma AD,Jochheim-Richter A,et al.Revaluation of bone marrow-derived cells as a source for hepatocyte regeneration[J].Cell Transplant,2004,13:659-666.

7.       Yannaki E,Athanasiou E,Xagorari A,et al.G-CSF-Primed hematopeietic stem cells or G-CSF per se accelerate recovery and Improve survival after liver injury,predominantly by promoting endogenous repair programs[J].Exp Hematol,2005,33:l08-119.

8.       中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎的诊断标准[J].中西医结合肝病杂志,2001,11(1):56-60

9.       Sukhikh GT, Shtil AA. Stem cell transplantation for treatment of liver diseases: from biological foundations to clinical experience (review).Int J Mol Med,2003,11:395-400.

10.   Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL,et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature,2002,418(6893):41-49.

11.   Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,et al.Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium[J].Nature,2001,410(6829):701-705.

12.   De Silvestro G, Vicarioto M, Donadel C, et al. Mobilization of peripheral blood hematopoietic stem cells following liver resection surgery[J].Hepatogastroenterology,2004,51:805-810.

13.   Muretto P,Angelucci E,Lucarelli G.Reversibility of cirrhosis in patients cured of thalassentia by bone marrow transplantation[J].Ann intem Med,2002,136:667-672.

14.   Am Esch JS, Knoefel WT, Klein M,et al.Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration[J].Stem Cells,2005,23:463-470.

15.   Wollert KC,Meyer GP,Lotz J,et al.Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction:the BOOST randomized controlled clinical trial[J].Lancet,2004,364:141-148.

16.   Avital I,Feraresso C,Aoki T,et al. Bone marrow-derived liver stem cell and mature hepatocyte engraftment in livers undergoing rejection[J].Surgery,2002,132(2):384-390.