视网膜母细胞瘤HXO-Rb44在兔眼种植的实验研究 赵军阳 孙宪丽

发表于2006年《眼科》

 

在对视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma, Rb）的药物和某些治疗方法的研究中，均以Rb细胞株的培养和裸鼠动物模型为基础，但此方法无法反映肿瘤真实的生物学特性，而且与人眼Rb相比存在巨大差异，所以应用范围有限，尤其不能满足手术操作性的实验研究。

兔是目前使用最多的实验动物之一，因价格便宜，容易饲养，兔眼与人眼大小相似，解剖结构比较清楚，便于观察，适合行手术操作性研究。能在兔眼建立Rb的异种原位种植动物模型，将有利于进一步开展更多、更广泛的实验研究。北京同仁医院眼肿瘤科赵军阳

 

材料和方法

一、细胞株来源

采用湖南医科大学培养的HXO-Rb44细胞株，在本院细胞培养室进行繁殖、培养。

二、实验动物

选择健康纯种日本大耳白兔5只及青紫蓝兔3只，体重2.0~3.0kg，性别不限，外眼及眼底正常，共16眼。在本院动物室清洁环境中分笼饲养。

三、Rb细胞培养及接种

将细胞株在培养基富含10%灭活小牛血清中培养，在RPMI1640培养液中生长，温箱恒定37℃，一周左右传代，继续分瓶培养。最终细胞浓度控制在1.17×10⁷/ml左右。分别抽取2ml安定和氯胺酮，兔后臀深部肌肉注射进行全麻，然后在室温下用1ml空针抽取Rb细胞混悬液0.1ml，一次全部注入脉络膜上腔，四环素可的松眼药膏涂眼。分别于种植后的1、3、7、14天（散瞳后用直接镜）观察记录兔眼部肿瘤生长情况。

四、肿瘤细胞的鉴定

取材：在肿瘤细胞植入后第14天选择）团块状和弥漫状生长的肿瘤兔眼各1只，全麻（方法同上）后处死并摘除眼球，即刻切开肉眼观察。取肿瘤组织块做病理切片，分别行苏木素-伊红（H-E）和免疫组织化学染色。免疫组化染色以神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）、兔抗人多克隆抗体（北京中山生物技术有限公司）及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acid protein，GFAP），兔抗人多克隆抗体（同上）为标记物，用链霉素卵白素-过氧化酶法染色，DAb-H₂O₂显色，以正常视网膜组织为对照。

 

结  果

一、大体观察

种植后1天及3天可见部分兔眼角膜轻度水肿，玻璃体轻度混浊；1周后肿物开始生长，2周长成明显团块状或弥漫状；其中白兔有5眼、灰兔有2眼种植成功，成活率为7/16；团块状生长的5眼（白兔3眼，灰兔2眼），弥漫性生长的2眼。团块生长者肿物为白色实性肿块，大小约3mm×5mm，表面呈毛绒状，质软，起自于睫状体平部后的视网膜，突向玻璃体（图1）。弥漫生长者沿球壁和玻璃体生长，呈白色膜状，无固定形状和边界，绒絮状，同时可见玻璃体腔和前房内有大量的悬浮细胞（图2）。

 

 

 

 

 

 

图1                      图2

二、组织病理学观察（H-E染色，光镜）

团块生长者肿瘤细胞沿巩膜穿刺口生长（图3），侵入并破坏脉络膜和视网膜，突向玻璃体；细胞生长活跃，生长区与坏死区相间隔；血管丰富，可见大片出血；肿瘤细胞显示出未分化的特点：细胞多数呈圆形、椭圆形、多角形，大小不等，核大深染，胞浆少，核与胞浆比例失调，核染色质浓染，异形性明显，有大量的核丝分裂像（图4）。弥漫生长者，在脉络膜内和视网膜下可见大量异形细胞沿球壁匍行生长，其内出血及坏死区与生长旺盛区相间隔，并有大量新生血管长入，细胞特点与团块状肿瘤相似。

 

 

 

 

 

 

图3                             图4

 

三、免疫组织化学染色：

肿瘤细胞NSE呈阳性反应（图5），细胞浆和细胞核被染成棕色； GFAP染色呈阴性反应（图6），细胞核为蓝色，细胞浆未被染色；对照组正常视网膜节细胞NSE呈阳性反应；正常视网膜中Müller纤维对GFAP呈阳性反应，被染成棕色。

 

 

 

 

 

 

图5                           图6

 

讨  论

一、建立兔眼Rb模型的意义

Rb是眼科婴幼儿时期最常见的眼内恶性肿瘤，恶性程度高，危害性大，也是目前研究最多的眼科肿瘤之一。通过对它的研究发现了人类的第一个“肿瘤抑制基因”?Rb基因^[1]，并由Knudsen 首次提出Rb发生的“二次突变学说”。1978年Francke^[2] 发现某些遗传型Rb患者全身体细胞中13q¹⁴有缺失。这些为其它肿瘤的研究奠定了基础，并使Rb相关的各种基础和实验研究大规模展开。

在本组实验兔眼种植成功眼内可见肿物生长，经病理及免疫组化检查，与人眼Rb的特点相一致，与徐和平等^[3]用HXO-Rb44在裸鼠上种植所得的结果一样。本实验说明，在兔眼种植Rb细胞是可以获得成功的，兔可以成为Rb理想的模型动物。

本组实验研究的意义在于：在国内首次建立了兔眼的Rb模型，扩展了眼科肿瘤的动物模型种类，方便以后进行更多、更广泛的研究。

二、与现有Rb实验对象的比较

目前许多实验均以Rb细胞株的培养和裸鼠动物模型为基础的，肿瘤细胞的体外培养无法反映肿瘤真实的生物学特性，应用范围有限。在动物体内进行肿瘤的原位种植是比较理想的研究方向，国内主要选择裸鼠^[4]，已在裸鼠眼前房和玻璃体种植Rb成功。因为裸鼠先天缺乏胸腺，不能生成正常的T细胞，无免疫机能，易致肿瘤的增生，且移植瘤基本保持原发肿瘤的生物学特性，1969年首次应用裸小鼠移植人体肿瘤获得成功^[5]。中山医科大学于1994年用SO-Rb50细胞系种植于裸鼠前房和颈背皮下，能很好地形成移植瘤。张哓玮等^[6]用HXO-Rb44细胞系种植于裸小鼠的玻璃体获得成功。但裸鼠的眼球与人类眼球相比，无论是形状、大小还是解剖结构，都相差甚远，即使做成Rb模型，在治疗及观察方面亦很困难，尤其不能满足手术操作性的实验研究。裸鼠价格昂贵，因缺乏免疫功能，容易受细菌、病毒、霉菌感染，造成实验中不必要的死亡，故需要特殊的SPF（Specific Pathogen Free，无特定病原体）饲养环境，不仅要对空气过滤，也要对裸鼠食物和实验用具消毒，增加了实验难度和成本，限制了许多治疗性实验研究。

与裸鼠相比，兔价格低，普通环境下饲养即可，作为实验动物具有悠久的历史，兔眼的解剖结构比较清楚，其大小也与人眼相似，适合进行操作性等实验研究，所以兔眼是眼科进行实验研究的首选对象。

三、视网膜母细胞瘤细胞株的选择

关于视网膜母细胞瘤细胞系，国内外有多个：Y-79^[7]，SO-Rb50^[9]，HXO-Rb44等；也有众多学者在研究^{[8]，[10]，[11]，[12]} 。湖南医科大学徐和平等^[3]于1994年，建成细胞系HXO-Rb44，并在裸鼠腋部皮下进行种植获得成功，在光镜下观察：肿瘤为实体瘤，瘤细胞呈圆形或低柱状，胞浆少，核大，核分裂相较多，细胞间质少，肿块中央有坏死，未见典型F-W及H-W蔷薇花样排列结构。免疫组织化学染色：对NSE呈阳性反应，对GFAP呈阴性反应，与本组的实验结果一致。张哓玮^[6]等也用Rb细胞系HXO-Rb44制成细胞悬液，注射于裸鼠的玻璃体腔，成功形成Rb移植瘤。综上所述，HXO-Rb44细胞系是研究较多，比较成熟稳定的细胞系，而且容易得到，所以选择此细胞系做动物实验。

四、兔眼肿瘤造型方法的特点

异种原位移植最能反映原发肿瘤的生物学特性，Rb来源于具有多向分化潜势的视网膜母细胞，为具有明显的神经元和光感受器细胞分化的神经元性肿瘤，因此最好选择动物眼内视网膜种植。我们选择睫状体平部的脉络膜为种植部位的原因是：脉络膜的血运丰富，能为肿瘤的生长繁殖提供足够的营养；其次，脉络膜紧贴视网膜，肿瘤细胞能够沿脉络膜向视网膜内生长；再者，此部位距角膜缘后约2mm，便于种植和实验操作。结果证明HXO-Rb44确实能够在兔眼内视网膜生长，并形成实性肿块，其生长方式、分化类型及肿瘤细胞特征与人眼Rb相一致。

五、肿瘤细胞的鉴定

1. 生长方式：人眼Rb分为内生型、外生型和弥漫浸润型。内生型：起自视网膜内层向玻璃体内生长并形成团块；外生型：起自视网膜外层向视网膜下生长并引起视网膜脱离；弥漫浸润型：肿瘤沿视网膜向玻璃体生长，不形成明显的团块。种植兔眼Rb：团块状生长者为白色实性肿块，起自于睫状体平部后的视网膜，突向玻璃体腔，类似人Rb内生型。弥漫性生长的肿瘤沿球壁生长，呈白色膜状，无固定形状和边界，类似人Rb弥漫浸润型。

2. 组织病理分型：人Rb分未分化型和分化型，未分化型最多见：瘤细胞为圆形、椭圆形、多角形，大小不等；胞浆少，细胞核大、呈圆形、强嗜碱性，可见核丝分裂，生长旺盛区与坏死区相间隔。分化型有3种：F-W蔷薇花，H-W蔷薇花，花状饰。兔眼Rb的组织病理特点为：细胞多数呈圆形、椭圆形、多角形等大小不等，肿瘤细胞生长旺盛区与坏死区相间隔；细胞核大深染，细胞浆少，核与细胞浆比例失调，核染色质浓，异形性明显，并可见大量的核丝分裂相（图4），与人眼未分化型Rb相似。

3. 免疫组织化学染色：肿瘤细胞对NSE呈阳性反应（图5）；对GFAP呈阴性反应（图6）。证明其来源于神经元，而非神经胶质组织。

六、本组实验存在的不足

在本组实验中，Rb肿瘤细胞种植成功率为7/16，与裸鼠种植相比，有明显差距，造成原因主要是未使用免疫抑制剂。兔本身具有强大的免疫系统，能够限制甚至杀死种植的肿瘤细胞；而且HXO-Rb44细胞系来源于人眼，对兔有很强的抗原性，容易引起兔免疫系统排斥，造成肿瘤细胞不易成活，所以成活率较低。如果同时对兔使用免疫抑制剂，破坏或者降低其免疫功能，可能大大提高种植肿瘤的成活率。

综上所述，HXO-Rb44细胞系可以在兔眼内成活，并能形成实体性肿瘤，其生长方式、分化类型及肿瘤细胞特征与人眼Rb相一致，经免疫组化染色证明其来源于神经组织。这种兔眼内常位异种移植模型更符合临床实际情况，为以后对Rb的治疗研究提供了更好的生物体内模型。