Livin α在膀胱移行细胞癌中表达研究

 

 

提要  目的  研究膀胱癌相关基因Livin基因在膀胱移行细胞癌组织中的表达，研究Livin基因表达与膀胱移行癌生物学行为的关系；研究抑癌基因P53基因在膀胱癌组织中突变，研究Livin表达与P53基因突变的关系。方法 100例膀胱移行细胞癌组织，设计Livinα引物，以半定量RT-PCR的方法，检测膀胱癌组织Livinα mRNA，以免疫组化法检测癌组织P53蛋白。将膀胱肿瘤病理分级、临床分期、是否复发癌等生物学行为及P53蛋白染色强度分别量化，与组织Livinα mRNA RT-PCR产物量进行等级相关分析。并以10例正常膀胱粘膜作为对照。结果  100例膀胱移行细胞癌，67例检测到Livinα mRNA表达，10例正常膀胱粘膜组织未检测到Livinα mRNA表达，Livinα mRNA在膀胱移行细胞癌组织中表达率高于正常膀胱粘膜有统计学意义（P<0.05）。Livinα mRNA在膀胱癌组织中表达与P53蛋白阳性、肿瘤病理分级有统计学相关联性（P<0.05）。结论  膀胱移行细胞癌组织中可见Livinα mRNA高表达，Livinα mRNA表达量与膀胱癌病理分级及癌组织中P53蛋白呈正相关。济宁市第一人民医院泌尿外科鹿占鹏

 关键词   膀胱癌 Livin  P53  RT-PCR

膀胱移行细胞癌是我国泌尿系最常见的恶性肿瘤，目前认为其发生和发展与细胞凋亡受抑制有关。细胞凋亡功能障碍导致细胞生存期延长，突变的异常细胞累积而形成肿瘤，细胞凋亡功能障碍与肿瘤的发生与发展密切相关。Livin是近年发现的凋亡抑制蛋白基因^[1]，表达产物有Livinα、Livinβ两种亚型，根据文献，膀胱癌组织中Livinβ不表达，而可见Livinα高表达^[2]。我们对Livinα在膀胱移行细胞癌的表达进行研究，并与P53蛋白表达及其与肿瘤病理分级、临床分期等关系进行研究。

1．材料与方法

1．1 临床资料

临床病理为我院泌尿外科2000.6~2005.12年住院膀胱癌患者，病理检查结果均为膀胱移行细胞癌，共100例。年龄范围34~85岁，平均63±17.4岁。男性76例，女性24例。病理分级：I级26例，II级43例，III级31例。临床分期：浅表型（Ta~T1）37例，浸润型（T2~T4）63例。

正常膀胱粘膜组织10例，取自同期因前列腺疾病等其它原因手术的患者，年龄范围45~72岁，平均61±9.8岁，男性7例，女性3例。

1．2  RT-PCR法检测组织Livinα mRNA表达

根据GenBank公布的Livinα及β-actin基因序列设计引物。Livinα上游引物：5’ TCCACAGTGTGCAGGAGACT 3’ ，下游引物：5’ ACGGCACAAAGACGATGGAC 3’， 扩增产物368bp；β-actin上游引物：5’ CCT AAG GCC AAC CGT GAA 3’ ，下游引物：5’ GGA GCC AGG GCA GTA ATC 3’ ，扩增产物168bp。从-70⁰C超低温冰箱取组织提取总mRNA，根据试剂盒说明书进RT?PCR反应，产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕后，在紫外灯下观察电泳带，凝胶成像分析系统拍照，应用软件测定电泳条带的密度值，计算目的基因片段电泳带密度与β-actin基因片段电泳带密度的相对值，以衡量目的基因的相对表达水平。每一标本分别取三次反应结果进行半定量分析，并求其均值。

相对系数＝	待测基因片断电泳条带密度	×100%
	β-actin 基因片断电泳条带密度

 

1．3 免疫组化检测

采用S-P免疫组化法。鼠抗人抗突变型P53抗体、S-P超敏度试剂盒、DAB酶底物显色剂均购自福州迈新生物技术开发公司。石蜡切片，常规脱蜡、水化，进行微波抗原修复，继以免疫组化试剂盒进行检测。操作步骤按说明书进行，DAB显色，苏木精复染。以预试验阳性片及PBS代替一抗设阳性及阴性对照。

结果判定：每个切片观察至少5个有代表性高倍视野，观察不少于1000个细胞，对免疫组化结果进行评估。

P53基因表达在细胞核内，以胞核内有呈黄色、棕黄色颗粒为阳性；其中以<25%细胞阳性为（+）；25%~60%细胞阳性为（++）；>60%细胞阳性为（+++）；

肿瘤病理分级根据WHO分类标准进行分级。

肿瘤临床分期根据国际抗癌协会（UICC）标准进行划分。

1．4 统计分析

对Livinα RT-PCR半定量分析结果、P53蛋白检测结果，病理分级、临床分期、年龄、性别和是否复发癌均进行量化后，利用SPSS10.0统计软件进行spearman等级相关分析。

2．结果

2．1 Livinα mRNA检测结果

100例膀胱移行细胞癌患者中，有67例可检测到Livinα mRNA表达，阳性率67%，10例正常膀胱组织中均未见Livinα mRNA表达，琼脂凝胶电泳未见特异电泳条带，阳性率为0%。Livinα mRNA表达阳性移行细胞癌组织产物半定量分析结果在57%-92%，平均(82.6±7.9)%。

膀胱癌组Livinα mRNA表达阳性率与正常膀胱组织阳性率差异进行卡方检验，Χ²=14.4，P=0，P<0.05。可认为膀胱癌组织Livinα mRNA表达阳性率高于正常膀胱粘膜组织有统计学意义。

图1 Livinα mRNA RT-PCR电泳图谱

（A阳性对照，B-F Livinα mRNA表达阳性，G-I Livinα mRNA表达阴性，J阴性对照。）

2．2  Livinα mRNA与P53表达相关性分析

P53蛋白主要定位于肿瘤细胞核中，检测结果31例阴性， 19例（+）； 24例（++）， 26例（+++）。量化后与Livinα mRNA表达半定量值进行Spearman等级相关分析，结果 r_s=0.465，P=0.002，P<0.05，Livinα mRNA表达与P53表达呈正相关，可认为二者统计学上有相关关系。

图2 膀胱移行细胞癌P53蛋白免疫组化染色（×200）

2．3  Livinα mRNA表达与病理分级相关性分析

Livinα mRNA检测结果与肿瘤病理分级量化后，进行Spearman等级相关分析，Livinα表达与病理分级呈正相关，Livinα阳性强表现为肿瘤分级高，r_s=0.463，P=0.002，P<0.05，可认为Livinα表达与病理分级统计学相关。

2．4 Livinα mRNA表达与临床分期相关性分析

Livinα mRNA检测结果与肿瘤病理分级量化后，进行Spearman等级相关分析，r_s=0.006，P=0.967，P>0.05，认为二者统计学上无相关性。

2．5 Livinα mRNA表达与其它因素相关性分析

将是否复发癌、年龄、性别等均量化后，进行Spearman等级相关分析，Livinα mRNA 表达与是否复发癌（r_s=0.114，P=0.363）、年龄无关（r_s=0.098，P=0.539），P>0.05。与男性性别有关（r_s=0.316，P=0.041，）P<0.05。

3．讨论

Livin是近年发现的凋亡抑制蛋白（Inhibitor of Apoptosis Protein，IAP）家族成员之一，Livin的异常高表达能抑制细胞凋亡，从而导致细胞的异常增生及其向恶性转化。Livin主要表达于胚胎和未分化成熟组织，在恶性肿瘤组织中可见高表达^[1]。

我们研究发现，在膀胱组织中未见Livinα表达，而在膀胱移行细胞癌中可见高表达（67%），同时肿瘤组织Livinα阳性率高者其恶性程度亦高。Livinα可通过与多种caspase结合，抑制其活性，并通调节细胞有丝分裂等途径抑制细胞凋亡，促进细胞增殖^[3]。在膀胱移行细胞癌中Livinα的高表达可能是癌细胞脱离生长监控，造成异常的增生，并使异常分化的细胞积累的原因，是膀胱移行细胞癌发生的始动因素之一。这种凋亡抑制因素的持续存在，也可能也是癌细胞恶性行为增高的因素。

在Livinα表达与肿瘤临床分期的关系中，我们未发现二者有相关性，可能的原因是肿瘤临床分期除与肿瘤恶性行为等内因有关外，亦与肿瘤发现与就治时间等外因有密切关系，受外因影响较大，而本文未将这些因素纳入研究，结果误差较大，尚待进一步的研究证实Livinα mRNA表达与临床分期的关系。

本研究发现Livinα表达与P53蛋白表达有密切相关性，Livinα高表达的癌组织中存在P53蛋白的高表达。P53基因是重要的抑癌基因，P53蛋白堆积是P53基因突变的结果，P53基因在大部分恶性肿瘤中有很高的突变率。野生型P53基因可在转录水平对其它癌基因如Bcl-2基因有下调作用^[4]。根据本研究结果，估计Livinα基因异常高表达可能因野生型P53基因的这种下调作用丧失的结果。而在瘤组织中导入野生型P53基因可能重新恢复对Livinα基因的下调作用，从而诱导癌细胞凋亡，这可能是在肿瘤组织内导入野生型P53基因促进肿瘤细胞凋亡的机理之一。癌组织中导入野生型P53基因是否可下调Livinα mRNA表达，尚待进一步研究。

本研究还发现Livinα表达与男性性别有关，但我们亦注意到研究中男女性别差异较大（76：24），可能有较大的样本选择误差，Livinα mRNA表达是否在男女患者存在差异，尚待收集更多女性病例进一步研究证实。本研究发现Livinα蛋白的表达与年龄和是否复发癌无统计学相关性。

参考文献

1. Kasof GM, Gomes BC. Livin, a novel inhibitor of apoptosis protein family member. J Biol Chem. 2001, 276(5):3238-46.

2. Gazzaniga P, Gradilone A, Giuliani L, et al. Expression and prognostic significance of LIVIN, SURVIVIN and other apoptosis-related genes in the progression of superficial bladder cancer. Ann Oncol. 2003 , 14(1):85-90.

3. Nishihara H, Kizaka-Kondoh S, Insel PA, et al. Inhibition of apoptosis in normal and transformed intestinal epithelial cells by cAMP through induction of inhibitor of apoptosis protein (IAP)-2. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003, 100(15):8921-6.

 

4. 朱朝辉,邢诗安,程平,曾甫清,鲁功成. 膀胱癌中p53突变及Bcl-2、PCNA表达与细胞的增殖和凋亡[J]. 华中科技大学学报(医学版),2004,(5).

 

The expression of Livinα gene in bladder cancer

LU zhanpeng WANG weiguo

(No1 Affiliated Hospital of Jining Medical College)

Abstract Objective  To investigate Livin gene expression in bladder cancer and the relationship between the Livin gene expression and the bladder cancer. To investigate p53 gene mutation in bladder cancer and the relationship between the mutation and the Livin gene expression. Methods  The Livinα mRNA expression and the p53 protein were studied respectively by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical staining. To quantificat the p53 protein staining and the bladder cancer pathologic grade, et al, then to investigate they relationships. Results  There were total 100 bladder cancers. Livinα mRNA was tested expression in 67 bladder cancer. There was no Livinα mRNA expression in 10 normal bladder tissue. The expression rate of Livinα mRNA in bladder cancer was higher than that in normal bladder tissue (P<0.05). In bladder cancer, the Livinα mRNA expression correlated to P53 protein expression and the bladder cancer pathologic grade (P<0.05).Conclusion The Livinα mRNA expressed in bladder cancer. The expression was correlate to P53 protein and the bladder cancer pathologic grade.

Key words  Bladder cancer  Livin  P53  RT-PCR