- 人类乳头瘤病毒(HPV)的检测方法
- 作者:陈继明|发布时间:2010-09-17|浏览量:1168次
摘要:人类乳头瘤病毒(HPV)与宫颈癌的发生和发展关系密切,HPV的检测已是宫颈癌早期筛查的一个重要方面。HPV的检测和分型对于了解宫颈癌病情变化、指导治疗、判断预后以及疫苗改进均具有十分重要的价值。本文将就HPV的检测方法的进展作一小结。
关键词:人乳头瘤病毒(HPV),宫颈癌,检测,疫苗常州市第一人民医院妇科陈继明
Abstract: Human papilloma virus (HPV) is strongly correlated with the pathogenesis and development of cervical cancer, the testing of HPV has been an important aspect of early screening of cervical cancer. The testing and classification of HPV is invaluable for acknowledging the advance of the disease, treatment, prognosis and the improvement of HPV vaccine. A summarization will be made in this article concerning with the advance of the testing methods of HPV.
Key words: human papilloma virus (HPV), cervical cancer, testing methods, vaccine
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一,占女性生殖器官恶性肿瘤的半数以上,严重威胁着妇女的健康。全世界每年大约有4万人患病,中国新发病例约计13万,占目前已发现的所有女性肿瘤的6%,是仅次于乳腺癌而引起妇女癌症相关死亡的重要原因。宫颈癌的发病机理目前尚不清楚,但已有很多研究证明,99%的宫颈癌组织中可检出人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)[1-2]。目前,已经明确HPV感染为宫颈癌前病变和浸润性宫颈癌发生的必要条件[3-4]。大量研究资料表明,HPV与宫颈癌及癌前病变密切相关,高危型HPV(HRHPV)感染与宫颈癌关系最为密切[5]。随着病变程度的加重,HPV的检出率也逐渐增高[6]。所以,许多专家提出将HPV的检测作为宫颈癌的一种筛查手段。目前,针对HPVDNA检测作为宫颈癌原始筛查方法以及与细胞学联合在筛查中的意义的研究报道较多[7-10]。本文将就HPV检测方法的相关内容进行小结,重点介绍目前应用最为广泛的PCR法和杂交捕获试验。
由于HPV至今尚不能在体外培养,又无合适的实验动物,因而对其检测主要依赖于形态学方法和分子生物学技术。目前HPV检测方法主要有细胞学法,斑点印迹法,荧光原位杂交法,Southern杂交法,多聚合酶链反应(PCR)法和杂交捕获法等。细胞学法敏感度和特异度较低;斑点印迹法具有放射性。目前较为公认的敏感度和特异度高的方法是捕获二代法;其它敏感度较高的方法有原位杂交,PCR法。但PCR法特异度很低,假阳性率较高;而核酶印迹原位杂交法复杂,不宜大规模临床使用。
1. 细胞形态学检测
宫颈 HPV 阳性细胞的特征性改变是出现了特异性挖空细胞。初期在表层出现,当不典型增生达2/3以上时,挖空细胞减少,此时表现为低分化鳞癌的形态特点。感染 HPV16,18 的宫颈上皮阳性为中层挖空细胞核出现了密集浓染的蓝紫色颗粒产物,从慢性宫颈炎→
CIN→CaCx,HPV 杂交信号渐强,由上皮表层到棘层,分布呈散在→簇状→弥漫状。
2. 免疫组织化学法
用SP法染色测 HPV16,18早期蛋E6 单抗能有效证明感染组织中存在的E6 蛋白,阳性标志为核内出现棕黄色颗粒。研究表明抗HPV16E6 单抗可直接定位于宫颈癌组织,对宫颈癌有较好定向选择性,有可能作为人宫颈癌放射免疫显影诊断的载体。
3. 基因扩增技术
3.1 HPV DNA 的PCR扩增 评价HPV检测方法最关键的因素是检测灵敏度,以基因扩增为基础检测HPV DNA,是目前最灵敏的检测方法,可检测出低水平的病毒感染,并且能够比较准确地对HPV感染状态进行分类,因此成为实验室和流行病学研究的理想工具。但是,由于基因扩增过程中污染造成的假阳性及技术成本高,目前不宜作为临床实验室HPV感染的常规检测。
3.2 荧光定量PCR (FQ-PCR) 技术 FQ-PCR是1995年由美国Perkin Flmer公司研制成功的一种新型核酸定量检测方法,该法将普通PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性有机结合,克服了传统PCR在许多方面的缺点和局限性。由于荧光探针的引入,而且被释放的荧光基团数目与PCR产物数量相同,使得该方法对DNA模板定量的准确性与特异性都有很大提高。常用的PCR扩增仪与传统PC R扩增仪相比,应用更广泛、定量测量、检测效率明显提高、扩增产物无需电泳分析、无管道内污染及结果重复性好等特点。由于HPV-16型特异引物可与HPV66型模板DNA发生错配,传统PCR法扩增时,常对两者的扩增产物不易区分而造成HPV 16假阳性结果,但应用FQ-PCR技术,HPV 66型DNA不能扩增,从而增强了HPV分型检测的特异性。此外,FQ-PCR技术检测HPV感染的敏感性较传统PCR法增高,当HPV16, 18, 31, 33, 35亚型含量平均为1拷贝基因组/300个细胞时,即可用此法检测到。
4. 杂交俘获试验
4.1第一代杂交俘获试验(hybrid capture test-Ⅰ,HC-Ⅰ) 为克服基因扩增技术的不足,几年前美国Digene公司开发出一种新的HPV DNA检测技术??第一代杂交俘获试验(hybrid capture test-Ⅰ,HC-Ⅰ)。其原理是利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测。HC-Ⅰ不需要基因扩增,利用两套单链全长RNA混合探针,可以检测5种低危型HPV(6, 11, 42, 43, 44)及9种高危型HPV(16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56 )。理论上检测灵敏度是 50 000个HPV DNA拷贝。经过临床试验评价,HC-Ⅰ检测灵敏度低于PCR及其他基因扩增技术,但其特异度和阳性预测值却高于PCR。
4.2 第二代杂交俘获试验(hybrid capture test-Ⅱ,HC-Ⅱ) 最近Digene公司推出的杂交捕获二代试验( HC-II )更敏感,由原先的试管法改为96孔平板法,提高了工作效率,降低了成本,更适于大人群的筛查。该法同时能检测13种高危型HPV (HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59和68型),已得到世界范围的认可。Petry等[8] 对德国8466例患者经HC-Ⅱ检测,发现HC-Ⅱ检测宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅱ级的敏感性远较常规细胞学高,前者是97.8% ,而后者是43.5% ,而且HCⅡ检测CINⅡ的特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为95.3% 、10.9%和100%,与细胞学检测基本吻合。HC-Ⅱ检测方法的缺点是不能测定具体的HPV型别。此外,HC-Ⅱ作为杂交反应,存在交叉杂交的问题,即与不在混合探针中的其他HPV型起交叉反应引起假阳性结果而降低特异性[11]。
4.3 第三代杂交俘获试验(hybrid capture test-Ⅲ,HC-Ⅲ) 杂交捕获Ⅲ(HC-Ⅲ)是Digene公司生产的新一代捕获杂交法,和HCⅡ一样也用RNA探针,但用一段带有生物素的寡核苷酸代替HC-II中的特异性抗体,将RNA DNA杂交体固定在链霉素包被的孔中。由于这段寡核苷酸与HPV DNA的另一段序列互补,从而减少了非特异性杂交造成的假阳性结果。而且这种检测方法能特异性地检测出靶序列的单个核苷酸的改变,从而使检测HPV基因型变异体成为可能。HC-Ⅲ也用混合探针,故也不能对HPV进行分型,加上专利的因素,使这种方法的研究和发展受到一定限制。
4.4 HC Express Array技术:Digene公司在杂交捕获法的基础上结合基因芯片推出了HC Express Array技术。这项技术利用芯片上固定的病毒不同亚型的特异性DNA探针,对病毒进行分型判断,此技术目前用于基因表型分析的研究,且该技术快速分型和定量的特点使其在HPV的分型检测中具有非常广阔的应用前景。
小结:HC操作比较简单,基本步骤如下:①样本DNA双链解离为单链;②DNA单链与全长RNA探针结合为RNA-DNA杂交复合物;③包被在试管壁或微孔壁上的特异性抗体与RNA-DNA杂交复合物结合,使之固定;④结合有多个碱性磷酸酶的第二抗体与RNA-DNA杂交复合物结合,使信号放大;⑤碱性磷酸酶使酶底物发光,分光光度计测量发光强度后与标准值比较,通过碱性磷酸酶的含量确定RNA-DNA杂交复合物的含量。
但是,HC也有一定的局限性,主要有:①检测结果阴性并不能排除HPV感染,因为可能存在病毒感染水平很低或者采样不正确导致的假阴性;②标本采集及保存有特殊的要求,必须应用Digene公司提供的专用器材及试剂,或者应用液基细胞学剩余标本;③不能区分HPV具体型别;④如果所得相对光单位值接近或者小于1. 0,则不能确定HPV感染。
5. 结语与展望
人乳头状瘤病毒(HPV)是引起宫颈癌及癌前病变的必要因素,宫颈癌的筛查是降低宫颈癌发病率最经济有效的方法,HPV的检测已是宫颈癌早期筛查的一个重要方面。许多研究支持将HPV检测传统的巴氏涂片结合, HPV检测阳性可作为细胞学检查ASCUS结果行阴道镜检查的指征,在一定程度上减少重复细胞学检查,减少阴道镜检查,减少在随诊中高危人群的丢失。此外,HPVDNA检测可以预示治疗后病变残存和复发的高危患者,同时血清HPVDNA可能成为宫颈癌治疗后的病情监测的有效肿瘤标志物。因此,HPV检测的临床意义不容忽视。
HPV的检测作为宫颈癌的筛查已逐渐向临床推广,但是不同的HPV型别有不同的致病能力,所以发展HPV 基因型的分型方法越来越重要。目前HC-Ⅱ法是唯一通过FDA批准的可在临床使用的一种检测HPV DNA的技术,但他不能对HPV进行具体分型,而且存在交叉杂交的问题。PCR扩增后进行测序不仅可以检测具体型别还可以检测所有型别,在一定改进之后有较大的发展前景。但是假阳性及技术成本高的问题,限制了他在临床常规检测中的广泛应用。针对现有方法的缺点和不足,通过不断的努力,将各种检测方法有机结合,取长补短,相信在不久的将来会产生简单、快速、方便、价廉,且敏感性、特异性很高的HPV检测方法应用于宫颈癌的筛查中。
参考文献
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