不同频率脉冲电磁场促人骨髓间充质干细胞增殖的实验研究

中国矫形外科杂志　2004年12月第12卷第23、24期　Orthop J Chin , Vol. 12 ,No. 23、24 December 2004 ?1867 ??实验研究?
宋晋刚　许建中　周　强　罗　飞　李洪鹏

摘　要　目的: 探求脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields , PEMF) 促进人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells , hMHCs) 增殖的适合频率。绵阳市中心医院骨科脊柱专科宋晋刚

方法: 选用场强1. 1 mT, 频率分别为5、25、50、75、100、150Hz 的PEMF 刺激hMSCs , 30min/ d , 光镜观察细胞形态, MTT法和流式细胞技术检测细胞增殖水平及生长周期。结果: 各频率组PEMF刺激均能促进MSCs 增殖; 频率不同, 促增殖的效应不一, 其中50Hz 频段效果最为显著, 生长曲线比对照组明显前移, S 期细胞百分比(28. 89 ±0. 25) %较对照组(13. 57 ±0. 55) %增高107 %。结论: 频率是PEMF 促进hMSCs 增殖的重要影响因素之一, 50Hz 为促进hMSCs 增殖的适合频率。
关键词　脉冲电磁场; 　间充质干细胞; 　频率; 　增殖
中图分类号　R687 　　　文献标识码　A 　　　文章编号　1005 - 8478 (2004) 23、24 - 1867 - 03
Effect of pulsed electromagnetic fields on accelerating human mesenchymal stem cells proliferation by different frequency∥SONG Jin2
gang , XU Jian2zhong , ZHOU Qiang , et al . Department of Orthopaedics , Southwest Hospital , the Third Military Medical University , Chongqing
400038
Abstract 　Objective :To research the suitable frequency of pulsed electromagnetic fields (PEMF) on human mesenchymal stem cells (hMSCs)proliferation. Method :The third generation hMSCs were irradiated by different frequency PEMF of 5 ,25 ,50 ,75 ,100 ,150Hz , 1. 1 mT,30min/ d. The method of MTTwas employed to evaluate the level of proliferation. The parameter regarding the variation of the cell cycle was detected with the flow cytometry(FCM) . Result : Different effect on accelerating MSCs proliferation by different frequency PEMF. The significant effect was at the frequency of 50Hz. The percentage of cells at the S phase (28. 89 ±0. 25) was increased 107 % compared with that of the control group (13. 57 ±0. 55) . Conclusion :Frequency is one of the most important factor on accelerating MSCs proliferation ,and 50Hz is the suitable frequency of PEMF accelerating  MSCs proliferation in vitro.

Key words 　Pulsed electromagnetic fields (PEMF) ; 　Mesenchymal stem cells (MSCs) ; 　Frequency ; 　Proliferation
△基金资助:国家高技术研究发展计划(863) 重大专项《组织工程技术修复长骨缺损及人工皮肤的研发》(2003AA205020) ;

重庆市科技攻关项目《组织工程骨与软骨优化制备及应用研究》(2003 - 13 - 6) ; 西南医院创新基金:人MSCs 体外快速扩增及诱导分化修复骨缺损的临床研究(2002 - 15)
作者单位:第三军医大学西南医院骨科, 　重庆市　400038
作者简介:宋晋刚(19762) ,男,四川省绵阳人,医师,硕士在读。研究
方向:骨组织工程和脊柱外科。电话: [phone] 　E2mail :
sjgfelix@163. net
　　骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell , MSCs) 作为一种成体干细胞, 具有极大的可塑性及多向化潜能, 是体外构建组织工程骨常用的种子细胞。目前种子细胞的体外扩增需要3 周左右时间, 如何使种子细胞快速、优质扩增是构建组织工程骨所面临的紧要问题。
    本实验旨在研究不同频率段脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields , PEMF) 刺激对体外MSCs 增殖的作用, 以期找出促进MSCs 增殖的适合频率范围, 为应用PEMFs 促进MSCs快速扩增, 研制新型生物反应器以及进一步研究PEMFs 促进MSCs 增殖的机制提供实验依据。
1 　材料与方法
1. 1 　主要试剂与仪器
Percoll 分离液(Sigma 公司, 美国) , DMEM/ F12 (1∶1) 培养基(Hyclone 公司, 美国) , 优质胎牛血清(Hyclone 公司,美国) , 四甲基偶氮唑蓝(MTT) (Sigma 公司, 美国) , 酶联反应检测仪(DG3022A 型, 华东电子管厂) , 流式细胞仪(Becton Dickinson , 美国) , 可调试脉冲电磁刺激仪(由解放军后勤工程学院陈俊斌教授提供)
1. 2 　方法
1. 2. 1 　hMSCs 的分离与培养
     无菌抽取20～30 岁健康志愿者两侧髂骨骨髓5～10ml ,肝素抗凝。用1. 073 g/ ml Percoll 液梯度离心, 以5 ×105/ cm2个细胞接种于培养瓶, 加含15 %胎牛血清的DMEM/ F12 培养液, 置37 ℃, 5 %CO2 饱和湿度培养箱内培养。待原代细胞铺满瓶底80 % , 以0. 25 %胰蛋白酶消化, 按1∶3 传代, 用含10 %胎牛血清的培养液继续培养。
1. 2. 2 　不同频率PEMF 刺激hMSCs
    取第三代hMSCs 消化离心, 吹打制悬, 分为对照组和不同频率PEMF 刺激组, 每组以1 ×104/ Cm2 接种于50ml 培养瓶及以5 ×103/ ml , 200ul/ 孔接种于96 孔培养板中。将刺激组置于PEMFs 的HelmhIz 线圈中, 两线圈呈对偶式, 间距10cm ,经霍尔效应测磁仪测得场强均匀性及稳定性良好。通过引线将线圈置于培养箱中, 设定场强1. 1 mT, 频率分别为5、25、50、75、100、150Hz , 刺激时间30min/ d。对照组细胞置于同等条件下的培养箱内, 不加PEMFs 刺激。
1. 2. 3 　MTT法检测细胞活性及生长曲线
    每天PEMFs 刺激结束后, 取各组96 孔板, 每孔加入5mg/ ml MTT溶液20μl , 继续培养4h 后吸弃孔内上清液, 加入二甲亚砜(DMSO) 150μl/ 孔, 电动振荡仪震动10min 使沉淀充分溶解后, 选择490nm波长, 每板设一不含细胞的调零孔,在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收OD 值。以时间为横轴, 光吸收OD 值为纵轴绘制细胞生长曲线。
1. 2. 4 　流式细胞仪检测细胞周期
    刺激组与对照组培养瓶细胞接种后第5d , 细胞融合近80 % , 消化离心, 各组待测细胞用PBS 洗涤2 次, 迅速注入预冷的75 %乙醇, 振荡混匀以1 ×106 个细胞密度悬浮固定细胞, 4 ℃过夜。经荧光染料染色后, 流式细胞仪488nm波长检测, 获得DNA 含量分布组方图和细胞凋亡比例。以增殖指数(proliferation index , PI) 分析PEMFs 对MSCs 分裂增殖水平的影响, 同时进行DNA 倍体分析。PI = [ (S + G2/M) / ( GO/G1 + S + G2/M) ] ×100 %。
1. 2. 5 　统计学分析
    应用SPSS 11. 0 统计软件, 采用单因素方差分析, F 检验对数据进行统计学处理。各频率组间数据采用Tukey 法进行多重比较, P < 0. 05 认为差异具有显著性意义。
2 　结　果
2. 1 　形态学观察
    倒置相差显微镜逐日观察hMSCs 生长情况和形态特征。传代细胞于接种后4h 完成贴壁, 24h 后贴壁细胞开始分裂增殖, 部分区域形成细胞集落, 细胞呈均匀一致的长梭形外观。3d 后经PEMFs 刺激的hMSCs 形态比对照组大, 数目校对照组多, 排列更为紧密; 各频率刺激组间细胞形态无明显差别, 数目有所不一, 以50Hz 刺激组细胞密度最大。
2. 2 　对hMSCs 增殖水平的影响
     经细胞增殖与活性的MTT 检测, 各刺激组与对照组OD值绘制成生长曲线如图1。由图中可见, PEMFs 刺激后的hM2SCs 增殖能力比对照组增强, 刺激组生长曲线较对照组前移,并且峰值增高。刺激频率不同, 细胞增殖速度不一, 以50Hz刺激组明显快于其他频率刺激组( P < 0. 05 ) 。
图1 　不同频率PEMF 刺激MSCs 生长曲线
(n = 12 , 各刺激组与对照组相比较, P < 0. 05 )
2. 3 　对hMSCs 细胞周期的影响
     经流式细胞仪检测, 各PEMFs 刺激组样本均未发现有DNA 倍体异常的细胞(diploid : 100 %) ; 各实验组细胞周期检测结果见表1。PEMF 刺激后的hMSCs 细胞周期发生了改变,S期细胞百分比较对照组增高; 刺激频率不同, 细胞周期改变不一, 其中50Hz 频段S 期细胞百分比(28. 89 ±0. 25) %较对照组(13. 57 ±0. 55 ) %增高107 %。各频率刺激组间作多重比较, 50Hz 频率显著高于其他频段组( P < 0. 05) 。这种改变与MTT方法测定的结果是相吻合的。
表1 　流式细胞仪检测不同频率PEMF 刺激后MSCs 细胞周期
组　别G0 + G1 细胞周期( x ±s)
S
G2 +M PI 值
对照组82. 93 ±0. 32 13. 57 ±0. 55 3. 5 ±0. 54 17. 07
5Hz 组70. 34 ±0. 25 21. 65 ±0. 26 8. 01 ±0. 32 29. 66
25Hz 组69. 07 ±0. 26 26. 09 ±0. 30 4. 83 ±0. 28 30. 92
50Hz 组63. 86 ±0. 45 28. 89 ±0. 25 8. 05 ±0. 63 36. 16
75Hz 组65. 95 ±0. 30 26. 58 ±0. 45 7. 48 ±0. 50 34. 06
100Hz 组72. 54 ±0. 56 21. 60 ±0. 63 5. 86 ±0. 42 27. 46
150Hz 组74. 31 ±0. 72 20. 44 ±0. 60 5. 25 ±0. 45 25. 69
　　n = 5 ,各实验组与对照组相比较, P < 0. 05
3 　讨　论
     利用组织工程的原理与技术促进骨系细胞的增殖与分化, 生成活体骨组织用于骨缺损的修复和再生, 有望解决临床修复大范围骨缺损的难题。构建理想的组织工程骨首先要有生物学特性较佳的种子细胞。间充质干细胞来源于中胚层, 是目前常用的种子细胞, 虽然具有很强的自我复制能力, 但由于细胞数量少, 在骨髓中的密度低, 大约只有十万分之一, 采用常规的培养方法, 难以在短期获得大量优质的
细胞来满足构建组织工程骨的需要。研究表明, 脉冲电磁场( pulsed electromagnetic fields ,PEMFs) 可启动骨的重建, 加速骨的发育; 促进成骨细胞的增殖、生长因子的分泌、细胞外基质的合成; 促进骨的形成和成熟等[1～3 ] 。MSCs 是骨修复过程中形成成骨细胞的重要始祖细胞之一, 因此我们推PEMFs 能够对MSCs 产生一系列生物学效应, 并促进成骨。这一推论在本实验室前期工作中得到了初步证实4 ,5 ] 。然而刺激的频率不同, 是否会对细胞增殖及细胞周期产生不同的影响? 在组织工程骨的构建中我们应该选择怎样的合适频率范围? 选择适当的参数对促进MSCs 的体外扩增及新型生物反应器的研制有重要意义。
     频率对电磁场产生的生物学效应有较大影响。研究认为, 电磁场产生生物学效应的频率范围大约在1～100Hz[6 ] 。骨骼系统的内生性活动频率范围在步态频率(1～5Hz) 到肌肉收缩的动力频率(10～100Hz) 间变化, Lee 等[7 ] 认为最有效的电磁场频率范围应接近机体正常功能活动频率。我们参考Bassett 等[8 ]关于不同参数PEMF 对骨折愈合影响的报道及相关文献, 在1～150Hz 频率范围选择5、25、50、75、100、150Hz 频段, 研究不同频率PEMFs 刺激对MSCs 体外增殖的作, 以用期找出促进hMSCs 增殖的适合频率。
     倒置相差显微镜观察发现, 经PEMF 刺激的MSCs 密度在细胞融合成单层之前明显较对照组高。MTT 法测定的原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将黄绿色的MTT 降解成蓝紫色的结晶并沉积细胞中, 而死细胞无此功能。利用流式细胞仪检测细胞周期, S 期细胞百分比升高, 表明细胞的DNA 合成速度增高, 细胞增殖加速。通过以上检测发现,PEMF 的生物学效应, 在细胞水平上, 表现为促进细胞的增殖; 在染色体DNA 水平上, 表现为对细胞周期的影响, 提高细胞的S 期百分比。5～150Hz 频率段PEMF 均能促进MSCs 体外增殖, 各频率刺激组间作多重比较, 发现50Hz 频段促增殖效应显著高于其他频段组( P < 0. 05 ) 。从5～50Hz , 随着频率的增加, PEMF 促MSCs 增殖作用逐渐增强; 从50～150Hz ,随着频率的增加, PEMF 促MSCs 增殖作用逐渐减弱。

     实验表明, 频率是脉冲电磁场促进hMSCs 增殖的重要影响因素之一, 刺激频率不同, 促进细胞增殖的效应不一,50Hz 为刺激促进MSCs 增殖的适合频率。本实验为骨髓间充质干细胞体外快速扩增提供了新的思路和依据, 并为新型生物反应器的设计提供适合的频率参数。关于PEMFs 促进MSCs增殖的生物学机制, 我们将在以后的研究中进一步探讨。
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[8 ] 　Bassett CA ,Valdes MG, Herandez E.Modification of fracture repair with
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(收稿:2004207217 　修回:2004209213)
中国矫形外科杂志　2004年12月第12卷第23、24期　Orthop J Chin , Vol. 12 ,No. 23、24 December 2004 ?1869 ?
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