基因治疗的发展现状和展望

基因治疗是一种新的治疗手段，可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾 病。癌症基因治疗是基因治疗的主要应用领域。过去几年里，全球基因治疗临床试验取得了很大的进步。实际上，基因治疗也遇到了很多困难。未来，基因治疗的主 要目标是发展安全和高效的基因导入系统，它们能将外源遗传物质靶向性地导入到特异的细胞江苏省沭阳县人民医院心脏内科徐健

 

1.      全球基因治疗临床试验情况

1989年，Rosenberg等就在位于贝塞斯达市的美国国立癌症研究院癌症治 疗部开展了人类第一个基因治疗临床试验，这一开创性的研究为之后的临床基因转移研究确定了许多重要的必备条件。此后，基因治疗的研究在全世界广泛开展，许多国家也相继批准了基因治疗的临床试验。近年来大量的基因治疗研究论文发表和临床试验获批表明，尽管1999年的腺病毒载体免疫反应导致的死亡事件和2002 年逆转录病毒的异常整合导致的患者白血病样表现事件曾经造成了一定的负面影响，但基因治疗的研究和开发并未因此而止步不前。从国家（地区）分布来看，无论是批准的临床试验数还是研究文献量都说明，美国、英国、德国在基因治疗的研究中领先，其中美国的优势尤其明显

自从1990年美国FDA正式批准第一个基因治疗临床试验以来，世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮。截止到1995 年，全世界共有100 多个基因治疗临床方案，在美国NIH 主持的评估中发现真正有效的方案仅几个，从而提出必须加强基因治疗中的关键基础问题的研究，加强了对基因治疗临床试验方案的审批和监管力度。从此，基因治疗从狂热转入理性化的正常轨道，并一直在稳健地发展。据统计，截至2004 年6 月底，全世界范围内基因治疗的临床试验方案已有987 个，截至2008年10月底，ISI Web of Science数据库已经共收录基因治疗的研究文献34791篇，截至2008年9月，全世界共已批准1472例基因治疗临床试验（数据来 源：The Journal of Gene Medicine数据库）。表明基因治疗具有良好的发展前景

在所有的临床试验方案中：(1)恶性肿瘤占全部基因治疗临床试验方案的首位，占总数的66%；(2) 心血管疾病占全部基因治疗临床试验方案的8.1%；(3) 单基因疾病占全部基因治疗临床试验方案的9.4%； (4)感染性疾病，主要是艾滋病毒(AIDS) 占全部基因治疗临床试验方案的6.6%；(5)其他疾病占全部基因治疗临床试验方案的2.9%；(6)基因示踪占全部基因治疗临床试验方案的5.3%。目 前这些基因治疗临床方案大多数处于Ⅰ / Ⅱ期临床试验阶段，其中Ⅰ 期临床方案有624 个，Ⅰ / Ⅱ期204 个，Ⅱ期131 个， Ⅱ / Ⅲ期11 个，Ⅲ期17 个。目前只有我国的重组腺病毒?? p53 抗癌注射液(商品名“今又生”)作为世界上第一个基因治疗产品正式上市，这不仅标志着我国能够在“点”上取得世界性的科技突破，也意味着我国有能力在生物 高技术产业化进程中抢占先机。总的来说，在基因治疗基础研究和临床试验及产业化各个领域，美国均领先于世界，其临床方案有662 个，占世界上总数的67%。

然而，如果我们冷静、公正地去审视这十几年来在基因治疗研究领域所取得的成绩，我们不得不承认其中还存在一些问题，主要是有效性和安全性。第一，目前进入Ⅲ期临床试验的只有17 个，而且大多数临床试验疗效有限；第二，法国巴黎 Necker 儿童医院因SCID 接受基因治疗的患者中有三名出现了类白血病样症状，表明基因治疗安全性问题有待于进一步解决

2.   我国基因治疗发展现状

与美国及欧洲相比，我国基因治疗基础研究和临床试验开展得较早，起点也不低。 早在20 世纪 70 年代，吴?院士就对遗传性疾病等的防治提出了基因治疗的问题。1985 年，他再次撰文指出基因治疗的重要目标是肿瘤。我国是世界上较早开展基因治疗临床试验的国家，基因治疗基础研究和临床试验基本与世界同步，复旦大学从 1987年就开展了血友病B 的基因治疗研究，1991 年，对两例血友病B 患者进行基因治疗特殊临床试验，这也是我国第一个基因治疗临床试验方案。之后，我国对单基因遗传病、恶性肿瘤、心血管疾病、神经性疾病、艾滋病毒等 多种人类重大疾病开展了基因治疗基础和临床试验研究。上海交通大学肿瘤研究所利用TK 基因转移治疗脑恶性胶质瘤是当时国内首先进入临床试验的肿瘤基因治疗方案。我国在心血管基因治疗方面也取得了一定进展，VEGF 治疗梗塞性心血管病和用人肝细胞生长因子基因治疗病理性瘢痕也取得了重大进展，其中VEGF 治疗梗塞性心血管病在北京安贞医院进行了特殊临床试验，这是我国第一个批准进入临床研究的心血管疾病基因治疗方案，也是继美国之后第二个开展心血管疾病基因治疗临床试验的国家。深圳赛百诺基因技术有限公司从1998 年开始进行重组腺病毒?? p53 抗癌注射液的临床试验，至2003 年完成了全部临床试验，于 2004 年1 月获得我国SFDA批准的新药生产批文(商品名“今又生”)。目前，我国已经有7~8 项基因治疗方案进入了临床试验阶段，并建立了国家“863”计划生物领域病毒载体研发基地，主要开展腺伴随病毒载体研发和产业化。另外，还有5~6 项基因治疗临床方案正在向国家SFDA 申请临床试验批文，20~30 项研究已完成或正在进行临床前试验，20 个左右项目进入了中试研究阶段，大多数基因治疗研究都具有创新性。

3　基因治疗面临的问题和挑战

基因治疗的发展经历了“乐观与热情?失望与怀疑?理性与挑战”的过程，这是符合事物发展规律的。目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。主要表现为：(1)基因导入系统缺乏靶向性，效率也较低。如以腺病毒为载体的p53 基因转移治疗恶性肿瘤的方案中，只能直接将腺病毒注射到肿瘤局部。若静脉注射，病毒颗粒将很快被清除，真正能够到达肿瘤组织的很少，难以达到治疗效果，且增加了副作用。前面提到的第一例逆转录病毒介导ADA 基因转移成功治疗SCID 的病例，因为导入效率较低，前后经历了11 次体外转导和回输。(2)目前针对遗传性疾病的基因治疗方案大多采用逆转录病毒载体，其插入或整合到染色体的位置是随机的，有引起插入突变及细胞恶性转化的潜在危险[9]。而理想的基因治疗方案应该是在原位补充、置换或修复致病基因，或者将治疗基因插入到宿主细胞染色体上不致病的安全位置。(3)理想的基 因治疗应能根据病变的性质和严重程度不同，调控治疗基因在适当的组织器官内和以适当的水平或方式表达。但目前还达不到这一目标，其主要原因是：现有的基因导入载体容量有限，不能包容全基因或完整的调控顺序，同时人们对导入的基因在体内的转录调控机理的认识有限。以上列举的问题代表了基因治疗领域的关键问 题，其核心问题在于基因治疗的靶向性，目前全世界范围内的科学家都在不同层面上对这些问题进行深入研究。基因治疗发展方向拟以改善和优化基因导入系统的靶向性和效率、构建新的基因定点整合载体、提高原位纠错效率，以及分离克隆新的表达调控元件和构建可控性表达载体为切入点，研究和解决这些关键问题。这些研究不仅将大幅度地提高基因治疗的疗效，还为基因治疗的最后成功铺平道路。

2005 年3 月4 日，美国FDA组织专家讨论基因治疗安全性问题。自2000 年以来，法国巴黎内克尔医院Fischer 教授对17 名患SCID的小孩实施基因疗法，当时疗效很显著，但是在2003 年，其中2名患者出现白血病症状，目前有一个患病小孩已经死亡，现在第三个小孩也出现了白血病症状。针对这一情况，美国FDA组织专家讨 论这一严重副作用是由于使用了特殊基因引起的孤立事件，还是所有基因治疗都会面临的共有问题。除了Fischer 教授的治疗方案出现严重副作用外，联邦专家提醒在美国国家心脏、肺和血液研究所利用逆转录病毒载体对42 只猴子开展的基因治疗试验，6 年后，其中一只猴子得了癌症并且已经死亡，这暗示基因治疗可能具有潜在的、长期的、延迟的副作用。

因此，美国FDA 已经停止了3 个与Fischer 教授临床试验类似结果的治疗方案，另外还暂时推迟了27 个基因治疗临床试验，直到他们能够确定这种导致癌症的副作用是由于特殊的环境引起的方可继续进行。

目前，科学家们把焦点集中在基因治疗的传递系统上，Fischer 教授的临床试验方案用的是逆转录病毒，这种病毒可以非特异性地插入到宿主细胞的基因组中，可能会导致难以预见的后果，如果插入到了一个癌基因附近，就可能引起癌症。现在很多研究者在研究新的安全、有效的基因传递系统，现在非病毒传递系统是一种很有前景的基因传递系统。

4.      溶瘤病毒用于癌症基因治疗

前述的分析已经说明，癌症治疗中的应用是基因治疗研究最为热门的领域，但是传统的基因治疗载体存在着安全性或有效性等问题。溶瘤治疗 (oncolytic therapy)是通过对自然界存在的一些致病力较弱的病毒进行基因改造制成特殊的溶瘤病毒(oncolytic virus)，利用靶细胞中抑癌基因的失活或缺陷从而选择性地感染肿瘤细胞，在其内大量复制并最终摧毁肿瘤细胞。溶瘤病毒用于肿瘤的治疗已经有近60年的 历史，已有大量研究对病毒的改造、给药途径探索、疗效观察、机制及危险性等方面进行了广泛探讨，对溶瘤病毒的认识有了很大进展，溶瘤病毒有望成为治疗肿瘤的重要武器。由于所用的病毒载体是经过特殊的基因质粒组装而成的具有复制活性的病毒，与其他用于肿瘤基因治疗的载体相比，溶瘤病毒在理论上具有更高的效 率。近年来，溶瘤病毒用于肿瘤治疗的研究发展非常迅速，有些溶瘤病毒已进入临床试验阶段，并取得了一些令人鼓舞的成果。目前，已有多种病毒因具有天然的嗜肿瘤特性而被用来改造成溶瘤病毒，包括单纯疱疹病毒-1(herpes simplex virus-1，HSV-1)、呼肠孤病毒(reovirus)、水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus)等。

5           基因治疗的发展方向

目前，基因治疗领域存在的主要问题是有效性和安全性。事实上，自1995 年以来，全世界基因治疗领域的科学家们在改善基因导入系统和载体方面作了大量的努力，新思路、新技术和新方法层出不穷。基因治疗的第一代载体设计存在较明显的缺陷。1999年，18岁的患有鸟氨酸氨甲酰基转移酶酶(ornithine transcarbamylase，OTC)缺乏症的格尔辛基死于基因治疗试验中。当时，去除了E1和E4基因的人类5型腺病毒载体含有人鸟氨酸氨甲酰基 转移酶的cDNA，从病人的右肝动脉注入。2002年，两名10岁的、患有罕见的X染色体连锁性重症联合免疫缺陷(X-linked severe cornbined immunodeficiency，SCID-X1)法国受治儿童出现白血病样表现，检查表明逆转录病毒整合到LM02原癌基因启动子附近导致了该基因的 表达异常。因此，病毒载体可能的毒性受到重视，而非病毒载体等的研究也得到了加强。

目前，在基因导入载体方面出现了两 大主流：一是非病毒载体系统；二是病毒载体系统。

非病毒载体主要包括改性的天然高分子和合成高分子两大类。改性天然高分子主要是脂质类(如固醇类)、多糖类(如壳多糖、右旋糖苷和藻酸等)、蛋白质类(如胶原蛋白、鱼精蛋白等)以及多肽类的物质。合成高分子则主要是一些可以生物降解的 (如聚赖氨酸、聚乳酸、聚乙烯醇及其嵌段或接枝共聚物等)、聚阳离子性的高分子(聚乙烯亚胺、聚酰胺树枝状高分子等)充当运送载体，分别以微球、囊泡或胶 束等形式包覆DNA，运送到达病理部位后进行释放。其中，目前已经应用于基因治疗的非病毒载体绝大多数是阳离子脂质体。

由于非病毒系统导入基因的效率相对较差，故在基因治疗临床试验中的使用率不到20%；但非病毒载体的生物安全性较好，特别是靶向性的脂质体、靶向性 的多聚物，以及脂质体/ 多聚物/DNA 复合物等新产品的出现，结合电脉冲、超声等新技术，明显提高了导入效率和靶向性，是今后非病毒载体发展的重要方向。

病毒载体在基因治疗领域的应用最为广泛，大约70%的治疗方案采用了病毒载体，包括各种逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、痘病毒等。这些 病毒载体有各自的特点，同时也存在各自的局限性。逆转录病毒能够选择性感染分裂细胞，并整合到宿主细胞DNA 上，长期存在于宿主基因组中 等特点，使之成为第一个利用病毒进行基因转移的工具。但是，重组逆转录病毒的感染和转导效率较低，外源基因随机插入，可能导致突变。为了提高基因导入效率，近年来新建立了慢病毒载体(lentiviral vector)系统，它不仅能整合到分裂细胞 DNA 中，对非分裂细胞也能整合，慢病毒载体对淋巴细胞、干细胞和多种肿瘤细胞具有较高的转导效率，因此倍受关注。此外，新建立的假型逆转录病毒载体，不依赖细胞表面的特异性受体，具有更广泛的宿主范围。此外，还必须深入研究逆转录病毒诱发癌症的机理，构建更为安全的载体。

腺病毒载体是基 因治疗中最常用的病毒载体，它具有包装容量较大、制备方便且易纯化和浓缩、宿主范围广、感染效率高等特点；但第一代腺病毒仍然存在许多缺点，如外源基因表达时间短、免疫原性较强、高滴度时有明显的细胞毒性等。近年来对腺病毒载体的改造非常活跃，产生了许多更安全、更有效的载体，如无病毒基因的无肠型腺病毒 载体、靶向性病毒载体、复制型腺病毒等。

腺相关病毒(AAV)因为不致病、宿主范围广、能够感染分裂与非分裂的细胞、能插入到宿主细胞染色体内或以染色体外串联体DNA的形式长期稳定表达 等特点，被认为是目前最好的载体，在遗传病的基因治疗方面应用显示出优势，也被越来越多用于治疗恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病以及应用于器官移植和组织工程研究。有研究发现腺相关病毒AAV8 是目前最有效的基因传递载体，可高效地将外源基因传递到肌肉和心脏。

基于同源重组和基因定点纠错原理，在DNA 水平的原位修复(靶向性)是遗传性疾病基因治疗的理想措施。与基因治疗载体系统相比，治疗基因表达调控的研究和进展相对滞后，主要受制于载体的包装容量。随着人类基因组计划的进展与完成，新的基因座控制区、隔离子、内含子、特异的启动子、增强子等的发现与分离，必定带动基因治疗向前发展。