60株金葡菌分泌表皮剥脱毒素A 及B及与临床疾病的相关性研究

60株金葡菌分泌表皮剥脱毒素A 及B及与临床疾病的相关性研究

  张霞 马琳^＊ 沈叙庄 杨永弘张桂荣 王咏红

首都医科大学附属北京儿童医院皮肤科 10045

[摘要]目的：探讨脓疱疮和金葡菌烫伤样皮肤综合征两者病原菌分泌表皮剥脱毒素的情况及与疾病的相关性。方法：分离脓疱疮和金葡菌烫伤样皮肤综合征患者的病原菌并保存，应用反向乳胶凝集法测定金葡菌产生表皮剥脱毒素的型别。结果：60株金黄色葡萄球菌中，51株（85%）检测到有表皮剥脱毒素产生，其中ETA阳性3(5%)株，ETB阳性8株(13%)，ETA和ETB均阳性40株(67%)。30株来源于金葡菌烫伤样皮肤综合征的金黄色葡萄球菌，29株（97%）有ET产生；单纯ETB阳性者8株(27%)；ETA和ETB均阳性21株（70%）。来源于脓疱疮的金黄色葡萄球菌30株中，22株（73%）有ET产生；单纯ETA阳性3(10%)株；ETA和ETB均阳性19株(63%)。其中来源于非大疱型脓疱疮的SA共15株，10株（67%）有ET产生。单纯ETA1株(7%)；ETA和ETB均阳性9株(60%)。来源于大疱型脓疱疮的SA共15株, 12株（80%）有ET产生；单纯ETA 2株(13%)；ETA和ETB均阳性10株(67%)。结论：北京及其周边地区来自儿童脓疱疮和金葡菌烫伤样皮肤综合征的金黄色葡萄球菌以产ET菌为主，其中大部分可同时产生ETA和ETB。单纯分泌ETA的金葡菌倾向于引起脓疱疮；单纯分泌ETB的金葡菌倾向于引起金葡菌烫伤样皮肤综合征。北京儿童医院皮肤科张霞

[关键词] 金黄色葡萄球菌；脓疱疮；金葡菌烫伤样皮肤综合征；表皮剥脱毒素；反向乳胶凝集试验

A correlative study between the serotype of exfoliative toxins and clinical diseases in 60 strains of staphylococcal aureus  

[Abstract]Objective To seek a possible correlation between the clinical manifestations and the serotype of exfoliative toxins(ET), and identify the association with the serotype and impetigo or staphylococcal scalded-skin syndrome(SSSS)).

Methods Sixty strains of staphylococcal aureus isolated from patients were studied.

Among them, 15 strains were isolated from bullous impetigo patients, 15 strains from nonbullous impetigo patients, 30 strains from staphylococcal scalded-skin syndrome

指导教师：马琳北京市自然科学基金资助 7062023 表皮剥脱毒素在儿童皮肤感染的金葡菌中的流行状况

(SSSS)) patients. The reversed passive latex agglutination has been used to detect

exfoliative toxin A and B. Results There are 51 exfoliative toxin producers were detected by the EXT-RPLA, including 3 serotype A producers and 8 serotype B producers, and 40 double producers. Of the 15 isolates from the skin of bullous impetigo patients, 12 isolates are positive for exfoliative toxin production, including 2 serotype A producers and 10 double producers , no serotype B producer. Of the 15 isolates from the skin of nonbullous impetigo patients, 10 isolates are positive for exfoliative toxin production, including 1 serotype A producer and 9 double producers, no serotype B producer. On the other hand, of the thirty Staphylococcus aureus isolates from SSSS patients, 29 exfoliative toxin producers were detected by the EXT-RPLA, including 8 serotype B producers, 21 double producers and no serotype A producer. Conclusion ETA is associated with impetigo and ETB is associated with generalized SSSS. ET -producing SA is the most common pathogenic bacteria in these two diseases.

[key words] Staphylococcus aureus(SA)；Impetigo；Staphylococcal Scalded Skin Syndrome(SSSS)；Exfoliative toxin(ET)；Reversed Passive Latex Agglutination Test (RPLA)

 

传染性脓疱疮的致病菌主要为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus Aureus，SA）。大疱型脓疱疮为金葡菌分泌的表皮剥脱毒素（Exfoliative toxin ，ET）作用于皮肤局部的结果。金葡菌烫伤样皮肤综合征（Staphylococcal Scalded Skin Syndrome ，SSSS）是大疱型脓疱疮的全身型，是表皮剥脱毒素作用于全身远隔部位皮肤的结果。为明确不同类型的脓疱疮及SSSS的致病菌分泌表皮剥脱毒素的型别有何差异，我们选取其中的60株来源于脓疱疮和SSSS的SA，分别测定是否分泌表皮剥脱毒素A及B，比较其分泌毒素种类的差别，从而了解北京及周边地区产表皮剥脱毒素的SA的流行情况并对SSSS的发病机制做进一步探讨。

 

 

材料和方法

 

一、对象

60株金黄色葡萄球菌全部分离自2003年3月至2004年12月就诊于北京儿童医院皮肤科的脓疱疮及金葡菌烫伤样皮肤综合征患者。其中，15株来源于大疱性脓疱疮，15株来源于非大疱性脓疱疮，30株来源于金葡菌烫伤样皮肤综合征患者。

二、实验方法

1．脓疱疮病原菌的分离培养及鉴定：对经临床明确诊断为脓疱疮的病人，由皮损处取分泌物培养后，根据菌落的形态、色素和产生溶血素来初步鉴别SA，再通过触酶试验、乳胶凝集试验(Slidex Staph Plus,biomerieux.Inc)、涂片和革兰氏染色鉴定。鉴定明确的SA进行纯培养增菌后用纸片法收集保存于-20℃冰箱备用。

2．对临床明确诊断为SSSS的患儿进行多部位取分泌物培养，阳性者留取金葡菌于-20 ℃冰箱备用。

3．反向乳胶凝集法(EXT-RPLA，购自日本生研公司)测定金葡菌产生表皮剥脱毒素水平试验步骤：

3．1．将复苏传代的单克隆SA菌株接种于含硝酸镉30ug/ml的脑心浸出液琼脂(BHIA)培养基35℃、18~24小时后，挑取1-5个菌落，接种于脑心浸出液液体培养基(BHI)3-5ml震荡培养18~24小时，以3000转/分的速度高速离心20分钟；提取菌液上清。

3．2．将EXT-RPLA试剂按说明配好，提前半小时放置于室温。用前充分摇匀。

3．3．分别吸取25ul待检菌液及阴性和阳性对照液于V孔中。

3．4．用稀释液将待检菌液和对照液倍比稀释为1：2；1：4；1：8；1：16；1：64及1：128；

3．5．用已包被好的含ETA及ETB特异抗体的试剂滴入已装有稀释菌液上清的测定孔，轻轻摇匀。室温下放置18~24小时，在黑色背景下读取结果，记录测定的ET-A及ET-B稀释倍数及滴度。

4．统计学处理：数据处理均采用SPSS11.0 for Windows软件，显著性检验采用行×列χ²检验。

结果

1、60株金黄色葡萄球菌中，51株（85%）检测到有表皮剥脱毒素产生；ETA阳性3(5%)株；ETB阳性8株(13%)；ETA和ETB均阳性40株(67%)；9株未检测到有ETA及ETB产生。

2、30株来源于金葡菌烫伤样皮肤综合征的金黄色葡萄球菌中，29株（97%）检测到有ET产生；无单纯ETA阳性株；单纯ETB阳性者8株(27%)，ETA和ETB均阳性21株（70%）,未检测出ET者１株(3%)。

3、来源于脓疱疮的金黄色葡萄球菌30株中，22株（73%）到有ET产生；单纯ETA阳性3(10%)株；无单纯ETB阳性株；ETA和ETB均阳性19株(63%)。其中来源于非大疱型脓疱疮的SA共15株，10株（67%）有ET产生。单纯ETA1株(7%)；无单纯ETB阳性株；ETA和ETB均阳性9株(60%)；未测到ET 5株(33%)。来源于大疱型脓疱疮的SA共15株, 12株（80%）有ET产生；单纯ETA 2株(13%)；无单纯ETB阳性株；ETA和ETB均阳性10株(67%)；未测到ET 3株(20%)。

4、对来自传染性脓疱疮和SSSS的SA分泌ETA和ETB的计数资料做配对χ²检验：p=0.000。行*列分割卡方检验来自大疱型脓疱疮和SSSS的SA：p=0.000；来自非大疱型脓疱疮与SSSS的SA：p=0.000；来自大疱型脓疱疮和非大疱型脓疱的SA：p=0.859。

讨论

近年来，国外有学者对SA分泌的表皮剥脱毒素做了相应研究。法国1981年对来自SSSS病人的SA进行测定，其中56%为产ET菌株。分别为单纯ETA4%，二者均分泌36%，单纯ETB16%^[1]。1998年Couppie P调查41株来自脓疱疮的SA，其中93%为产ET株^[2]。2001年法国测定1996年前48株来源于脓疱疮的SA中，其中88%为产ET菌株^[3]，其中12株来源于大疱型脓疱疮的SA均至少产生一种ET(100%)，非大疱型脓疱疮的36株SA种有30株产ET（83%）。本研究显示，60株来源于儿童脓疱疮和SSSS的SA有85%产生表皮剥脱毒素，与2001年法国检测结果相似，高于1981年法国检测结果。其中来源于非大疱型脓疱疮的15株SA，10株（67%）有ET产生；来源于大疱型脓疱疮的SA共15株, 12株（80%）有ET产生；略低于2001年法国研究结果。来源于SSSS的SA共30株，29株（97%）有ET产生，比例高于上述研究结果。

欧美国家大多数儿童SSSS病例与产ETA的SA 相关，少数病例与同时产生ETA和ETB的SA 相关，只有4%与单纯ETB株相关^[4]。Sander Kong等发现，产ETB的菌株造成的脓疱疮的严重程度和受累面积均比较严重^[5]。尽管ETA及ETB均可引起大疱性脓疱疮，但产ETB菌株更易引起儿童SSSS，并可引起健康成人发生SSSS^[6]。一项对日本健康儿童检测的研究中发现^[7]，抗ETA及ETB抗体滴度在1-3岁呈下降趋势，之后逐渐上升，在8岁后到达稳态，且抗ETA抗体普遍高于抗ETB抗体滴度，并得出结论，在日本，产ETB菌株与SSSS有更大的相关性。我国国内对此方面的资料上尚未见报告。

在本研究中所有被测菌株，有85%产生表皮剥脱毒素，提示本地区来源于脓疱疮和SSSS的SA绝大部分为产表皮剥脱毒素株。各组SA均有60~70%的菌株同时产生ETA和ETB，提示在本研究地区及时间范围内，同时产生ETA和ETB的SA在引起SSSS和脓疱疮的菌株中占大部分。本研究仅在SSSS组检测到单纯产ETB菌株(27%)，无单纯产生ETA菌株。在脓疱疮的菌株中有单纯产ETA菌株(10%)，无单纯产生ETB菌株。这提示，产ETB菌株可能倾向于引起SSSS，单纯产ETA的菌株, 可能趋向导致脓疱疮。

[参考文献]

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[3] A. Gravet, P. Couppié, O. Meunier, et al, Staphylococcus aureus Isolated in Cases of Impetigo Produces Both Epidermolysin A or B and LukE- LukD in 78% of 131 Retrospective and Prospective Cases, Journal of Clinical Microbiology, 2001, 39. 4349-4356 

[4]Willard D,Monteil H,Piemont Y,et al. Exfoliative toxin A and B genes from staphylococcus aureus.[J] Bacteriol 1987;169:3904-9

[5] SanderKning, Alex van Belkum,Susan Snijders et al, Severity of Nonbullous staphylococcus aureus Impetigo in Children Is Associated With Strains Harboring Genetic Markers for Exfoliative ToxinsB, Panton-Valentine Leukocidin, and the Multidrug Resistance Plasmid pSK41：Journal of Clinical Microbiolgy, 2003,41,3017-3021

[6]S. Ladahani: Recent developments in staphylococcal scalded skin syndrom.Clinnical Microbiology and Infection,2001,7:301-307

[7]Atsusshi .Kawabata, Satoshi Ichiyama, Yoshitsugu, IInuma, et al. Exfoliative Toxin Detection Using Reversed Passive Latex Agglutination: Clinical and Epidemiologic Applications: Journal of Clinical Microbiology,Aug.1997,p.1984-1987