RASSF1A基因在星形细胞瘤组织中的表达及临床意义

rassf1a基因在星形细胞瘤组织中的表达及临床意义

郑州大学第五附属医院神经外科;   450052 郑州

王新军 ，武跃辉，高涛，李培栋,

 [摘要]  目的 探讨rassf1a（ras相关区域家族1a）基因转录表达与星形细胞瘤发生发展的关系。方法 采用半定量rt-pcr、蛋白印记法和免疫组化技术对50例手术切除的星形细胞瘤及27例正常脑组织中rassf1a的表达情况进行检测。 结果 rassf1a在所有正常脑组织中表达，而在星形细胞瘤组织中存在较高的表达缺失率（66%），此结果与蛋白印记法检测结果一致。星形细胞瘤组织中的rassf1a阳性表达率（34%），与正常脑组织（100%）相比差异有显著统计学意义（x²=49.63，p＜0.01）。rassf1a表达与患者的年龄和临床病理分级显著相关（p＜0.05）。 结论 rassf1a转录表达缺失可能参与调控星形细胞瘤的发生发展过程，并进而影响其生物学特点及临床预后。郑州大学第五附属医院神经外科王新军

[关键词] 星形细胞瘤； 基因表达； rassf1a； 逆转录聚合酶链反应

[中图分类号]  r 730.264    [文献标识码]  a

the expression and clinical significance of the rassf1a agene in astrocytoma tissues. wang xin-jun, fan dong-mei, wu yue-hui, gao tao. department of neurosurgery, the fifth affiliated hospital of zhengzhou university,( zhengzhou  450052 , china.)

 [abstract] objective to investigate the expression of rassf1a gene(ras association domain family 1a gene) in astrocytoma tissues. methods the expression level of rassf1a gene in the astrocytoma tissues in 50 samples and  human normal brain tissues in 27 samples was detected with rt-pcr,western blot and immunohistochemisty methods. results  rassf1a mrna was identified in all the normal brain tissues, but not found in 66%of astrocytoma tissues. the similar result can be gain by western blot. the loss rate of rassf1a mrna was related with pathological grade and  the patients’age（p＜0.05）. conclusion: loss or abnomal down-regulation of rassf1a mrna is a frequent event in astrocytoma, which may play an important role in the malignant progression and prognosis of astrocytoma.

[key words] astrocytoma; gene expression; rassf1a; reverse transcription polymerase chain reaction

rassf1a基因与多种肿瘤的发生、发展密切相关。目前认为该基因表达失活主要是由杂合子丢失（loh）和启动子区特异的高甲基化造成，尤其是rassf1a启动子区的高甲基化，已经在广泛肿瘤谱中被发现。但目前有关rassf1a基因在星形细胞瘤组织中的转录表达以及与临床病理关系的研究报道甚少，为此本研究对星形细胞瘤组织进行了rassf1a基因表达的检测，旨在探讨rassf1a基因与星形细胞瘤发生发展的关系。

1  资料与方法

1.1 一般资料

收集我院选取2001～2006年手术切除的新鲜髓母细胞瘤标本50例，其中男33例，女17例，年龄8～47岁，平均14.1±2.4岁。全部标本均经病理确诊，按who分级，?级7例，?级4例，?级22例，?级17例。另随机选取27例同期颅脑损伤患者手术获得的无神经系统肿瘤的正常脑组织标本作正常对照,对照组男性20例，女性7例，年龄21～51岁，平均37.9±4.2岁。标本收集时， 从被切除标本的癌灶中央无出血坏死部位切取癌组织标本，并切取正常脑组织作为对照。标本一次性取材200mg,立即放入-80℃冰箱保存，其余组织均常规做石蜡包埋切片，切片厚4μm，1张切片做he染色复查诊断和组织学分级，另一张做rassf1a的免疫组化染色。

1.2  主要试剂

逆转录试剂盒及pcr相关试剂均购自promega公司（美国）rassf1a及二抗购自santa cruz biotechology公司（美国），抗羊s-p试剂盒购自福州迈新公司，trizol试剂及western印迹系统购自invitrogen公司（美国）。

1.3  方法

1.3.1 半定量rt-pcr：取低温保存的的标本50～100mg，加trizol试剂匀浆后抽提出总rna。取2μg总rna进行逆转录，以2μl逆转录产物作为半定量pcr的模板，建立pcr反应体系，具体方法参照试剂盒说明书进行。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。rassf1a引物序列：上游引物：5＇-tggagcgggacacgaacg-3＇，下游引物：5＇-tgcggcctgacactt-3＇，扩增产物片段长度为267bp。以β-actin内参照，其上游引物序列为5＇-atcatgtttgagaccttcaaca-3＇，下游引物序列为5＇-catctcttgctcgaagtcca-3＇，扩增产物长度为317bp。pcr反应条件：94℃ 4min后，以60℃作为退火温度循环30次，72℃延伸10min。取8μl反应产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察电泳结果，用flour-s^tm凝胶成像系统进行图像保存和分析。

1.3.2  蛋白印迹法（western blot）：取低温保存的标本，在蛋白裂解液中充分匀浆，高速离心后取上清液，测定蛋白浓度。取100μg蛋白上样进行sds-page电泳，用半干转膜仪将蛋白转置硝酸纤维膜上。封闭后依序加一抗（1：150）和二抗（1：750），最后用nbt-bcip进行显色。

1.3.3 免疫组化方法：根据抗羊s-p试剂盒说明书进行操作，并常规设立阴性和阳性对照。

1.4  统计学分析  应用spss13.0统计学软件，对本组资料进行配对t检验、卡方检验及相关性分析。

2.  结果

2.1     rassf1a mrna和蛋白在星形细胞瘤组织中的表达   所有正常脑组织中rassf1a mrna均全部阳性表达（27/27），rt-pcr产物电泳结果显示，在267bp处可见阳性条带；而50例星形细胞瘤组织中有33例表达缺失，表达缺失率为66%（33/50）。二者相比差异有统计学意义（p＜0.001。蛋白印迹法检测结果与pcr法结果完全一致。

2.2    免疫组化染色结果   rassf1a主要分布于胞核中，以＞10%的瘤细胞胞核内出现深棕黄色为阳性结果，着色弱者则为阴性。星形细胞瘤的rassf1a的阳性表达率为34%，正常脑对照组中阳性表达率为100%，两者相比差异有统计学意义（χ²=49.63，p＜0.01）。

2.3  不同临床病理指标的星形细胞瘤组织中rassf1a mrna的表达  见表1。rassf1a mrna的表达缺失与星形细胞瘤的病理分级和年龄明显相关，随着病理分级的增加而显著升高（p＜0.05）。

 

 

 

表 1 不同临床病理指标的星形细胞瘤组织中rassf1amrna的表达

类别           n        rassf1amrna缺失例数   表达缺失率（%）  χ²    p值

病理分级

?级         7             2                       28.5

?级         4             2                       50.0

?级        22            17                       77.2       6.916   0.031

?级        17            16                       94.1

年龄

?40岁     41            37                       87.7

＞40岁      9             2                       22.2       6.934   0.008

 

讨论

ras相关区域家族1a（rassf1a）基因是dammann等^[1] 于2000年报道从3号染色体短臂克隆出来的新型候选抑癌基因，因其表达产物中含有与ras蛋白结构相关区域，因而得名。rassf1a基因与ras的效应基因同源，位于3号染色体短臂3p21.3。1998年sekido等首次将该缺失区确定在一个120kb的最小纯合缺失区内^[2]。现已发现，rassf1a基因由于选择性剪接和启动子的不同，形成3个主要的转录本，即rassf1a、rassf1b和rassf1c，其中最普遍最重要的是rassf1a^[3，4]。rassf1a基因的cdna全长为1873bp，内含编码340个氨基酸的开放阅读框架，由6个外显子顺序拼接而成，依次分别为1α、2αβ和外显子3～6。外显子3～6编码ras相关区域^[5]。rassf1a基因在所有正常组织中均表达，在绝大多数恶性肿瘤组织中却表达缺失。rassf1a作为抑癌基因的作用机制目前尚不明确，可能通过以下机制发挥作用：①rassf1a基因可能就是编码着ras促进细胞凋亡作用的特有效应蛋白，它的失活破坏了ras的平衡作用，导致了细胞的恶性转换^[5]；②rassf1a基因可能通过与微管结合调节中心体和纺锤体的功能，进而调节微管的稳定性，rassf1a还可能与cdc20结合抑制后期促进联合体（apc）来调节有丝分裂的进展^[6]；③rassf1a可抑制cyclind1的积聚，并能增强p120(e4f)和cyclin2基因启动子结合，抑制cyclin2表达，从而阻滞细胞周期g1期向s期转变^[7，8]。

在本实验中，我们发现rassf1a在正常脑组织中均表达，而在星形细胞瘤组织中存在较高的基因表达缺失，两者有显著差异（p <0.01），说明rassf1a表达的缺失，在mrna转录水平表达失活而丧失了对星形细胞瘤发生的抑制作用，可能是导致星形细胞瘤形成的一个重要原因，rassf1a基因可能是星形细胞瘤的重要相关抑癌基因之一。在rassf1a半定量分析中发现，rassf1a基因表达缺失与星形细胞瘤患者年龄和病理分级密切相关。肿瘤恶性程度越高，rassf1a基因表达缺失率就越高，特别是在?级和?级组更为明显，这一实验结果与本组病例的临床资料、术中所见相符，与文献报道一致^[9]。rassf1a基因表达缺失与年龄的关系，与文献不同^[10]，有待于进一步对随访病例的观察和研究。总之，无论免疫组化还是rt-pcr和蛋白印记法检测，rassf1a基因在星形细胞瘤组织中都显示明显表达缺失，说明rassf1a基因表达缺失可能在星形细胞瘤恶性进展中发挥一定作用, 检测rassf1a可作为一种有潜在应用价值的生物分子指标来用于星形细胞瘤的早期诊断和预后的判断。

参考文献

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