Bcl-XL反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲体外治疗恶性胶质瘤的实验研究

bcl-xl反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲体外治疗恶性胶质瘤的实验研究

王新军 ， 武跃辉, 李培栋，付旭东， 寿纪新，刘泉郑州大学第五附属医院神经外科王新军

郑州大学第五附属医院神经外科  郑州 450052

[摘要]  目的：探讨bcl-xl反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲（acnu）体外治疗恶性胶质瘤的治疗作用。方法：采用阳离子脂质体介导的反义寡核苷酸体外治疗法、rt-pcr、mtt法和流式细胞术对恶性胶质瘤细胞进行了体外治疗。结果：bcl-xl反义寡核苷酸联合acnu治疗组对肿瘤细胞抑制率为88.63%，对bcl-xl mrna表达的抑制率为88.76%，并可显著下调bcl-xl蛋白的表达。肿瘤细胞凋亡率为80.54%，与对照组、空白组、nodn组、acnu和asodn组相比较，均具有显著差异（p＜0.05）。结论：bcl-xl反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲可有效抑制恶性胶质瘤的细胞增值，bcl-xl高表达是恶性胶质瘤对嘧啶亚硝脲耐药的又一重要因素，通过反义寡核苷酸下调bcl-xl的表达，可显著增强恶性胶质瘤对嘧啶亚硝脲的敏感性，为恶性胶质瘤的临床治疗提供又一理论依据。

[关键词] bcl-xl；反义寡核苷酸；嘧啶亚硝脲；恶性胶质瘤细胞

[中图分类号] r730.5   [文献标识码] a  [文章编号]

therapeutic effection of bcl-xl antisense oligodeoxynucleotide combination with nimustine  in human glioblastoma

wang xinjun¹ , li peidong², shou  jixin²,et al.1） department of neurosurgery, the affiliated  xiehe  hospital,tongji medical college,huazhong university of technology ,wuhan 430022 ;2）department of neurosurgery,the fifth affiliated hospital of zhengzhou university; zhengzhou  450052 ;3）henan key laboratory of tumor pathology, zhengzhou  450052

abstract:[objective] to study the therapeutic effection of bcl-xl antisense oligodeoxynucleotide(asodn) combination with nimustine(acnu)  in human glioblastoma a-172 cell lines. [methods] the methods of targeted therapy with cationic liposome-mediated asodn in vitro, rt-pcr ,mtt assay and flow cytometry were used to systemlly study. [results] the group of asodn combination with acnu, the proliferation inhibitory rate is 88.63%, the expression inhibitory rate of bcl-xlmrna is 88.76%, the expressin of bcl-xl was decreased  significantly.the apoptosis rates by flow cytometry is 72.38±8.16%,  there are significant difference between the combination group and the cell control group,the vacuitycontrol group, the nodn group,the asodn group and the acnu group,respectively(p＜0.05).[conclusion] the bcl-xl antisense oligodeoxynucleotide combination with acnu could effectively inhibit the proliferation of glioblastoma  cells,bcl-xl is an important factor for acnu resistance and the suppression of bcl-xl expression by the specfic antisense oligodeoxynucleotide can significantly increase the sensitivity of glioblastoma  cells to acnu.it would offer an important therapeutic foundation to clinical therapy of maligent glioma.

keywords:bcl-xl；antisense oligodeoxynucleotides；nimustine；maligent glioma.

胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,在临床实践中，对胶质瘤的治疗尽管进行了多种多样的研究及尝试，但至今临床治疗仍是一个世界性难题^[1]。化疗作为综合治疗的重要手段，疗效不理想，重要原因一是大剂量给药产生的副作用，二是耐药。反义基因治疗具有高特异性、高生物活性和低毒性的优点，是肿瘤基因治疗的重要手段。但二者联合治疗对恶性胶质瘤研究甚少，本研究用嘧啶亚硝脲（nimustine，acnu）联合bcl-xl反义寡核苷酸对恶性胶质瘤治疗进行探讨，现报告如下。

1  材料与方法

1.1  主要试剂  胶质母细胞瘤a-172购于上海细胞所。反义bcl-xlmrna硫代寡核苷酸（asodn）的序列链为5'-aaagtatcccagccgccgtt-3'，无关序列寡核苷酸（nodn）序列为5'-catatcacgcgcgcactatg-3'，bcl-xl引物序列：上游：5’-cccagaaaggatacagctgg-3’；下游：5’-gcgatccgactcaccaatac-3’扩增片段为448bp。β-actin参引物序列：上游：5’-atgtggcaccacaccttctacaatgagctgcg-3’；下游：5’- cgtcatactcctgcttgctgatccacatctgc-3’扩增片段为502bp，均由北京奥科生物工程公司合成。mtt（噻唑蓝）购自santa cruz公司。

1.2  方法

1.2.1  细胞培养与分组  将冻存的人胶质母细胞瘤a-172细胞株复苏后接种于rpmi 1640培养基中孵育箱内培养。将生长良好的a-172细胞用0.2%胰蛋白酶消化、离心收集后调整浓度为1×10⁶，重新分别接种于预置有盖玻片的96孔板中和25cm²的培养瓶中。并于接种后48h分组治疗：细胞对照（a组）、空白对照（b组）、nodn（c组）、终浓度为200ug/mlasodn（d组）、25ug/mlacnu（e组）及asodn和acnu的联合治疗（f组）。在细胞培养状态下，每24h用倒置显微镜观察各组细胞生长状态和形态学改变。72h后收集各组细胞进行相关检测。

1.2.2  细胞增殖活性的测定（mtt法） 治疗72h后，在不弃去rpmi 1640培养液的情况下，每孔中加入20ulmtt液，37℃，5%co2孵育箱内4h，弃去上清液，每孔加入100ul二甲亚砜振荡后，用mtt法，在酶标仪上测550nm处个孔的光吸收值，以细胞琥珀酸氧化脱氢酶（sdh）活性受抑制的情况作为监测方法记录结果。

1.2.3细胞bcl-xlmrna水平的rt-pcr检测  实验步骤严格按照trizol试剂所附的操作说明要求进行，离心收集各组细胞，提取细胞总rna，经过紫外分光光度法定量和鉴定。在25μl的扩增体系中分别加入10×rt-pcr缓冲液2.5μl、25mmol/l mgcl25μl、10mmol/ldntp2.5μl,rna酶抑制剂0.5μl，amv逆转录酶0.5μl，bcl-xl上下游引物及内参β-actin上下游引物各1μl,实验样品rna 1μg，进行rt-pcr扩增。最后分别取6μl扩增产物在1%的琼脂凝胶中进行电泳，紫外线透视仪下观察结果，并用凝胶成像仪分析系统测定灰度值，计算bcl-xl/β-actin的比值，获得目的片段的相对含量。

1.2.4  流式细胞仪检测凋亡细胞  治疗后48h,0.2%胰蛋白酶消化细胞，离心分别制备各组单细胞悬液，作细胞计数。用annexin v-fitc和pi合染细胞，未治疗空白对照细胞另设未染色管、单染annexin v-fitc管及单染pi管。以annexin v-fitc单染管和pi单染管作为基准参照，测定每个上样管数据，按所配制的软件处理、分析，选取散点图作直观显示。按试剂盒原理说明，判定标准如下：q1区：pi(+) annexin v(-)，坏死细胞区；q2区：pi(+) annexin v(+)，凋亡晚期或死亡细胞区；q3区：pi(-) annexin v(-)，活细胞区；q4区：pi(-) annexin v(+)，早期凋亡细胞区。在本试验中所测凋亡细胞数为q2区+q4区所得的细胞数。

1.3  统计学处理  采用spss10.0软件对相应数据进行?²检验、t检验、q检验及方差分析,以α=0.05作为检验水准。

2  结果

2.1  治疗后细胞形态学改变  治疗后48h,倒置显微镜下观察发现，在细胞对照组、空白对照组和无关序列寡核苷酸组，细胞均呈上皮性贴壁生长，轮廓清晰，结构紧密，生长状态良好；而在反义寡核苷酸组、acnu治疗组合联合治疗组，细胞部分变圆浮起，细胞间接触变松，增殖速度减慢，并见细胞中颗粒增多，细胞周围碎片增多。联合治疗组细胞脱落、漂浮、皱缩更加明显。

2.2  治疗后细胞增殖活性的抑制作用（mtt法）  结果见表1，按细胞对照组、空白对照组、nodn组、acnu组、asodn组及联合治疗组的顺序，抑制率逐渐增高。

表1  bcl-xl-asodn 联合acnu对a-172细胞sdh活性抑制作用( ±s)

组别                 a               抑制率%

a组              0.785±0.098               0

b组              0.741±0.032               5.67

c组              0.702±0.014              10.57

d组              0.401±0.056              58.54

e组              0.326±0.056              48.92

f组              0.089±0.046              88.63

注：f组、e组、d组分别与a组、b组、c组 ；f组与d组、e组相比，

均p<0.01; a组、b组、c组组间及d组与e组相比，p>0.05。       

2.3  治疗后细胞中bcl-xl mrna水平的变化  结果显示，与细胞对照组相比，空白对照组及nodn组无明显变化，asodn组、acnu组和联合治疗组的表达依次减弱，抑制率依次增加见表2，图1。

表2  bcl-xl-asodn 联合acnu治疗后bcl-xl mrna的表达

组别                   相对表达量                  抑制率（%）

a组                  0.98±0.11                      0

b组                  0.96±0.14                     2.04

c组                  0.92±0.32                     6.12

d组                  0.48±0.26                     51.02

e组                  0.54±0.33                     44.89

     f组                  0.11±0.22                     88.76 

注：f组e组d组分别与a组b组c组相比，f组分别与d组和e组相比，均p<0.01;d 组与e组及及a组、b组、c组间两两相比,p>0.05

2.4  治疗后各组细胞annexin v-fitc和pi合染结果  结果显示，凋亡细胞数按细胞对照组、空白对照组、nodn组、acnu组、asodn组、联合治疗组的顺序递增见表3。

表3 治疗后a-172细胞fitc/pi合染结果（%）

  组别       q1         q2        q3          q4         q2+q4

a组   1.23±0.34  2.76±0.45  94.63±2.42   1.38±0.63    4.14±1.08

b组   2.11±1.12  4.23±1.89  91.57±3.38   2.03±1.27    6.26±3.16

c组   3.23±1.15  4.49±1.75  89.99±4.46   2.18±2.35    6.67±4.10

d组   2.78±1.24  14.67±3.38  59.34±5.59  23.21±4.58   37.88±7.96

e组   3.34±2.37  16.20±3.42  55.84±7.67  24.62±4.03   40.82±7.45

f组   3.81±.17   29.35±3.57  23.81±5.87  43.03±4.59   72.38±8.16

注：f组、e组、d组与a组、b组c组相比，f组与d组e组相比，均p<0.01

  d组、e组及a组、b组、c组间两两相比，均p>0.05。

3          讨论

在临床实践中，对恶性胶质瘤的治疗，国内外学者进行了多种多样的研究和尝试^[2,3]。广泛切除和放疗，可以延长患者生存时间，但几乎所有的肿瘤患者均出现复发。化疗作为术后非常重要的治疗手段，其主要机制之一就是通过促进肿瘤细胞的凋亡而起到治疗目的的。但由于传统化疗药物几乎无一例外地都在杀死肿瘤细胞的同时，对人体正常组织及细胞也造成极大的伤害，使得化疗药物的应用至今在临床上一是受到大剂量副作用的限制，二是受耐药的影响，临床实际疗效有限。亚硝脲类药物由于其高度脂溶性，容易通过血脑屏障，可在肿瘤细胞内释放出活泼的烷化基团，造成肿瘤细胞的dna损伤，最终导致肿瘤细胞死亡，是治疗恶性胶质瘤的首选药物，但其实际临床有效率仅20-32.3%%^[4]。本研究结果也进一步证实，acnu对胶质瘤细胞的抑制率和凋亡率分别只有48.92%和45.84%。因此，耐药是化疗药物疗效偏低的主要原因，是肿瘤治疗的一大难题，也是恶性胶质瘤综合治疗失败的一个重要原因^[2]。

许多研究表明,诱导恶性肿瘤细胞凋亡是化疗药物发挥杀伤作用的重要机制之一,而凋亡抑制基因的过度表达使肿瘤细胞对化疗药物敏感性下降，bcl-xl就是其中之一^[5-8] 。自asodn应用研究以来，已证实在体内外具有特异性抑制基因表达的能力，联合asodn和其它化疗药物已成为肿瘤研究中非常重要策略^[2,9，10]。本研究结果显示，bcl-xl作为内源性凋亡通路中重要抑制因子，单纯经过bcl-xl asodn下调bcl-xl的表达之后，对凋亡率的影响也只有47.27%。但是，acnu联合bcl-xl asodn共同作用于a-172细胞，mtt、fc的结果分别为88.63%、80.54%，明显地抑制了肿瘤细胞的生长与增殖，提高了细胞凋亡率。说明bcl-xl-asodn对acnu抗肿瘤具有明显的增效作用。bcl-xl asodn转染细胞后，bcl-xl mrna水平的表达下调了51.02%，表明：bcl-xl-asodn进入细胞后的直接作用就是封闭bcl-xl mrna的表达，并影响到转录后水平及蛋白质的表达。提示我们，通过下调bcl-xl表达能够显著提高acnu的抗肿瘤作用，进而揭示出，bcl-xl在恶性胶质瘤细胞中的高表达可能是胶质瘤耐药的又一重要因子。

综上所述，bcl-xl反义寡核苷酸联合嘧啶亚硝脲可有效抑制恶性胶质瘤的细胞增值，bcl-xl高表达是恶性胶质瘤对嘧啶亚硝脲耐药的重要因素之一，通过反义寡核苷酸下调bcl-xl的表达，可显著增强恶性胶质瘤对嘧啶亚硝脲的敏感性，为恶性胶质瘤的临床治疗提供又一理论依据。

参考文献

---

基金项目：河南省教育厅自然科学研究项目（2007320067）

△     通讯作者：王新军，博士生导师，主任医师，教授；研究方向：脑肿瘤的基础研究和综合临床治疗。