野生型p53对纤维肉瘤细胞线粒体结构和功能的影响研究

实用肿瘤学杂志 2009年10月发表

  潘海乐（通信作者）

 

     【摘要】目的 观察野生型p53?wtp53?基因对纤维肉瘤细胞线粒体结构和功能的影响，探讨wtp53的抑癌机制。方法 将5周龄昆明鼠随机分为单纯肿瘤组??组?和wtp53基因治疗组??组?，建立纤维肉瘤动物模型，5d后?组动物于荷瘤局部注射表达wtp53基因的重组腺病毒液0.1ml，?组同一部位注射等剂量生理盐水。两组动物于2次注射后10、20、30d分批处死，estabrook法分离提取线粒体，clark氧电极法进行线粒体呼吸功能的测定，reer法测定游离［ca²⁺］浓度。结果 ?组中r₃显著高于?组;10天时两组r₄接近，但20天和30天时?组r₄时相大大延长，与?组比较差异非常显著;?组rcr随着时间的延长无明显变化，?组中，rcr随时间延长而下降明显低于?组；游离［ca²⁺］浓度在10天时与?组接近，而后大幅度上升。结论 wtp53明显降低线粒体呼吸功能，增加线粒体的通透性，从而从促进细胞凋亡方面发挥对纤维肉瘤的治疗作用。哈尔滨医科大学附属第二医院骨关节、骨肿瘤外科潘海乐

【关键词】wtp53 ；纤维肉瘤；线粒体。

the inference of wtp53 gene on mitochondrions stecture and mechanism of wild-typep53 as tumor suppressor gao feng, pan hai-le，qu bo, tian jun, tao tian-zun, et al. department of orthopaedics ,second hospital attached to medical university of harbing 150086 ,heilongjiang province, china

【abstract】objective: to investgate the infmence of wtp53 gene on mitochondrions stecture and mechanism of wild-typep53 as tumor suppressor. methods: ninety kunming mice?5weeks? were randomly dtvided into?i? control group and ??? wtp53-therapy group.au mice were subcutaneously ingected with s₁₈₀ fibrosavcoma suspension liguor ?0.2ml? at femur of posterior limb. five days after first injection ,the mice were injected with sterile saline wator ?0.1ml? and wtp53 adenovious liguor respectively at the fivst-injection area.two groups of mice were separately authanised at 10th, 20th and 30th day after the second injection.draw out of the mitochondrion with eseabroob method,respiration of mitochondrion use the method of ca²⁺ with reef method. results:r₃ in group ? was significantly higher than ?;r₄of the two gronps were closely at 10th while extended at soth or 30th day in group ?,and there existed significantly difference;rcr in group ? had not found the obviously changing;while in group?rcr was decneased sharply than geaup ?,fvee concentration of ca²⁺was similar among the 10 days and then increased clearly.conclusion: wtp53 can obviously reduce the respiration of mitoohondrion,increasing the penetratim of mitochondrion and suppress tumor through reducing proliferation and inducing apoptosis of tumor cells.

【key words】:p53； fibrosarcoma；mieochondrim

p53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，具有降低和阻止细胞向恶性转化的作用^[1]。p53有野生型（wt）和突变型（mt）两种，野生型可以抑制肿瘤细胞的生长。线粒体是维持细胞以至整个机体生理活动的能源基础，被称为人类第25号染色体^[2-3]。

 

 

作者简介：高峰，硕士 黑龙江省哈尔滨市哈尔滨医科大学附属二院急诊创伤外科

0451-86605047 e-mail：gao feng19761222 @.163.com

 

我们利用昆明鼠建立纤维肉瘤动物模型，研究wtp53对纤维肉瘤细胞线粒体结构和功能的影响，探讨野生型p53的抑癌机制。

材料与方法

 1.材料：表达wtp53的重组腺病毒液，由中国军事医学科学院提供，s180纤维肉瘤细胞株购自黑龙江省肿瘤医院。实验动物：5周龄昆明鼠，雌雄不限购自黑龙江省肿瘤医院肿瘤动物室。主要实验仪器包括 himaccr21台式低温高速离心机，电热恒温水浴箱，自动平衡仪，850型荧光分光光度计等。

2.实验方法：将昆明鼠随机分为?单纯肿瘤组和?wtp53基因治疗组，每组45只，均于单侧后肢股部皮下注射s180纤维肉瘤细胞悬液0.2ml，注射后5d?组动物于同一部位注射生理盐水0.1ml，?组注射表达wtp53基因的重组腺病毒液0.1ml。小鼠第二次注射后10、20、30d分批处死，每批每组15只。处死后切取肉瘤组织，一部分用于线粒体结构和功能的测定；另一部分用于线粒体内游离钙浓度的测定。（1）线粒体呼吸功能的测定：根据estabrook法分离提取线粒体，clark氧电极法进行线粒体呼吸功能的测定，安装装置、试剂配置、描记曲线，计算r₃、r₄、rcr=r₃/r₄。（2）线粒体内游离钙浓度的测定采用reer法 ［ca²⁺］?=kd（f-fmin）/（fmax-f）（mol/l）.

3.统计方法：数据采用均数±1倍标准差?x±s?表示，采用t检验。

结    果

      1．以suc为底物的线粒体r₃?nmo10/mgpr/min?变化?表1?:?组中r₃显著高于?组差异明显。

表1  以suc为底物的线粒体r₃?nmo10/mgpr/min?变化

组别	10天	20天	30天
?组 ?组	19.24±0.33* 13.61±0.26	20.79±0.14* 14.10±0.34	18.03±0.31* 13.57±0.29

注；?组与?组比较，p＜0.01。

       2．以suc为底物的线粒体r₄?nmo10/mgpr/min?变化?表2?：10天时两组r₄接近，但20天和30天时?组r₄时相大大延长，与?组比较差异非常显著。

表2．以suc为底物的线粒体r₄?nmo10/mgpr/min?变化

组别	10天	20天	30天
?组 ?组	4.08±0.33* 4.89±0.11	3.99±0.34* 7.05±0.16	4.03±0.41* 7.67±0.16

注；?组与?组比较，p＜0.01。

 

 

3．以suc为底物的线粒体rcr?表3?：?组rcr随着时间的延长无明显变化，?组在wp53注射后rcr明显下降，与?组比较差异有显著性?p＜0.05?。

   表3  以suc为底物的线粒体rcr的变化

组别	10天	20天	30天
?组 ?组	4.75±0.21* 2.43±0.72	5.27±0.19* 2.01±0.71	4.64±0.33* 1.77±0.19

注：?组与?组比较，p?0.05

2. 线粒体内游离ca²⁺水平测定结果?表4?：?组线粒体内游离ca²⁺水平无明显变化，?组在10天时线粒体内游离ca²⁺水平与?组接近，但在20天和30天时大幅度上升，与同批次?组相比差异非常显著?p＜0.01?。

 

表4  线粒体内游离ca²⁺水平检测结果?nmol/l?

组别	10天	20天	30天
?组 ?组 p值	745.60±2.97 788.19±2.47 ＞0.05	765.33±3.04 1384.70±2.98 ＜0.01	681.62±2.54 1357.32±1.92 ＜0.01

注：?组与?组比较，p＜0.01

讨    论

纤维肉瘤是来自成纤维细胞的恶性肿瘤，由于其早期即可出现远隔转移加之其本身对放化疗不敏感导致其预后差，5年生存率约为30%左右^［4］。

基因治疗是恶性肿瘤治疗的新方法，也是治愈肿瘤的希望所在，wtp53是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因，具有降低和阻止细胞向恶性转化的作用。目前wtp53对纤维肉瘤的治疗作用及机制报道较少，潘海乐^[5]等对此进行了较为系统的研究。本实验结果显示，wtp53可通过促进肿瘤细胞凋亡来实现对纤维肉瘤的抑制作用。wtp53促凋亡机制十分复杂，近年来线粒体与凋亡关系的研究取得了很大进展，并认为线粒体很可能处于凋亡调控的中心位置^［6］。本实验对线粒体呼吸?态?r₃?、呼吸?态?r₄?以及线粒体内游离钙浓度［ca²⁺］水平进行了检测 ，目前国内外尚未见到在体通过上述指标进行有关线粒体与凋亡关系的研究报道。呼吸?态和呼吸?态是评价线粒体氧化磷酸化功能的良好指标^［7］，r₃速率依赖于快速氧化期间的任何一个限速步骤，而r₄速率则反映了线粒体膜的通透情况。在本实验中，?组r₃显著低于?组，说明?组中atp的产生发生了障碍；而20天时r₄的时相延长，显著高于?组，反映出线粒体内膜通透性增高。呼吸控制率rcr的降低则是r₃降低和r₄升高共同导致，说明氧化磷酸化的偶联受损。另外，?组中r₃降低而r₄升高，说明底物载体、底物脱氢酶和呼吸链均未受影响，因此r₃的低值提示atp合成酶的活力降低或腺苷酸移为体的结构发生了改变。ca²⁺是重要的胞内信号传导因子，其稳态失调是细胞凋亡中的一个普遍现象，有报道在凋亡过程中细胞内ca²⁺浓度和空间分布都发生了变化^［8］本实验中?组在20天时出现了ca²⁺的异常蓄积，与?组相比差异显著，也进一步说明了线粒体的结构遭到了破坏。综合分析以上结果，可以看出在注射wtp53后，线粒体的结构和功能均出现了异常。线粒体的结构破坏和功能障碍^［9］除直接诱发凋亡外还将引发线粒体的释放反应，释放细胞色素c，凋亡诱导因子，胱冬酶原等死亡促进因子参与胱冬酶活性的调节而影响凋亡信号的传导。总之，线粒体可能主要通过电子呼吸链功能紊乱导致膜的通透性改变、释放caspase激活蛋白，改变细胞内氧化还原能力，参与细胞凋亡的调控，但有关的研究还很不充分。由于线粒体在细胞凋亡的调控中具有举足轻重的地位，随着对线粒体在细胞凋亡的调控机制的深入理解，必降对肿瘤的放疗、化疗及生物治疗提供新的思路和策略。

参考文献

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5.  潘海乐，张志鹏，曲波等。wtp53对纤维肉瘤端粒酶活性及bcl-2，c-myc基因表达的影响，中华实验外科杂志，20041：77～79。

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7.     shigenaga mk，hagen tm，ames bn.oxidative damage and mitochondrial decay in aging.proc natl acad sci usa,1994,91,10771～10778.

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9.     derfuss t,fickenscher h,kraft ms,et al.antiapoptosis activating of the herpervirus saimiri-encoded bcl-2 homolog:stabilization ofmitochondria and inhibition of caspase-3-like activity.j virol,1998,72:5897～5904.