- 骨髓间充质干细胞移植对胶原诱导性关节炎滑膜增殖的影响及机制
- 作者:赵福涛|发布时间:2013-06-21|浏览量:1336次
【摘要】 目的 探讨骨髓间充质干细胞(mscs)移植对胶原诱导性大鼠(cia)滑膜增殖的影响及可能的作用机制。方法 分离培养sd大鼠mscs。将40只sd大鼠,随机分为5组,空白对照组、早期mscs治疗组(初次诱导的同时注射mscs)、晚期mscs治疗组(再次诱导的同时注射mscs)及其相应对照组早期cia对照组(初次诱导的同时注射生理盐水)和晚期cia对照组(再次诱导的同时注射生理盐水)。mscs和生理盐水均从尾静脉注入。疗效观察包括关节炎指数(ai)、关节病理评分及酶联免疫吸附试验(elisa)检测血清血管内皮细胞生长因子(vegf)、肿瘤坏死因子(tnf)-α和白介素(il)-17等。结果 ①早期治疗组和晚期治疗组的ai、关节病理评分较相应对照组明显下降(p<0.05);②早期治疗组与晚期治疗组比较,ai与关节病理评分较低,差异有统计学意义(p<0.05);③早期治疗组、晚期治疗组血清vegf、tnf-α、il-17水平降低(p<0.05),与ai和关节病理评分呈显著正相关(p<0.05)。结论 mscs移植可减轻cia的滑膜增殖,其机制有可能是通过下调vegf、tnf-α和il-17的表达来实现的。上海交通大学医学院附属第三人民医院风湿免疫科赵福涛
【关键词】 间充质干细胞;移植;滑膜增殖
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, ra)的主要病理表现之一是滑膜类似肿瘤样生长【1】,形成血管翳。新生血管的生成是产生和维护血管翳的重要标志,也是造成滑膜炎、骨和软骨破坏的原因。因此, 抑制滑膜细胞增殖成为治疗ra的主要策略之一【2】。近年来mscs的负性免疫调节作用为自身免疫性疾病的治疗提供了新的研究方向,但是对cia滑膜的增殖有何作用尚不十分清楚。本研究就mscs移植对cia滑膜组织增殖的影响进行评价并对其可能的机制作初讨。
材料与方法
一 、材料
1. 实验动物:健康雄性sd大鼠,清洁级,平均体质量为(180±20)g,购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,合格证号为scxk(沪)2007-0005。
2.主要试剂与仪器:低糖(lg)-德氏修正伊氏培养基(dmem)、胎牛血清(fbs)购自美国gibco公司;mscs成脂诱导液及油红o染料,成骨诱导液及alizarin red染料均购自广州赛业公司。bm-mscs流式细胞术检测所用抗体购自abcam公司;牛ii型胶原(cii)和完全弗氏佐剂(cfa)购自chendrex公司;vegf、tnf-α、il-17酶联免疫吸附试验(elisa)试剂盒均购自r&d公司。co2培养箱,美国thermal公司,酶标仪,bio-rad公司;流式细胞仪,bd公司,epics×l。
二 、方法
1. sd大鼠mscs的分离、培养及鉴定:全骨髓贴壁筛选法分离培养mscs。具体方法:断颈处死sd大鼠,无菌分离大鼠股骨和胫骨,从中间剪断骨髓腔,用5ml注射器吸取5ml l-dmem反复冲洗骨髓腔,收集细胞悬液离心洗涤,以含10%fbs 100u/ml青霉素和100u/ml链霉素的l-dmem重悬后,以1×107密度接种于培养瓶,置于5%co2、370c培养箱内培养。48h后首次换液,之后每三天换液。当细胞长至80%~90%融合后,用0.25%的胰酶-0.02% 乙二酸四乙酸(edta)按1:2比例消化传代。传至3代以后的mscs用于表型和纯度鉴定以及实验组cia的治疗。
流式细胞术检测mscs表面标记:取第3代mscs进行细胞表面标志物的检测,0.25%的胰酶-0.02%edta消化离心后以磷酸盐缓冲液(pbs)制成1×106/ml的悬液,与异硫氰酸荧光素(fitc)标记的cd29、cd45室温避光反应30min,pbs反复冲洗2-3次后上流式细胞仪检测。
诱导mscs成脂分化:细胞融合80%~90%时,常规胰酶消化,l-dmem重悬后以2×104个/cm2接种于6孔板,置于37℃、5%co2培养箱培养。细胞100%融合后,去掉上清,每孔加入2ml成脂诱导a液,3天后去掉a液,加入2ml成脂诱导b液,24h后换回a液。重复循环a/b液3~5次后,用b液连续培养7d,每3d换液一次。用油红o染色检测mscs分化为脂肪细胞的情况。
诱导mscs成骨分化:细胞融合80%~90%时,常规胰酶消化,l-dmem重悬后以2×104个/cm2接种于6孔板,置于37℃、5%co2培养箱培养。细胞100%融合后,去掉上清,每孔加入2ml成骨诱导液。每三天换液一次。
2. cia大鼠模型的建立及分组:cia诱导:牛cii5mg,溶于2.5ml0.01m ph3.2冰醋酸溶液中,实验前一日配制,4℃冰箱过夜。与2.5ml完全弗氏佐剂(cfa)反复乳化,制成含牛iic1?/ml乳化液。初次免疫采用尾根部、背部皮内多点注射,实验组每只大鼠注射免疫复合物0.5ml。14日后加强免疫,腹腔注射免疫复合物0.5ml。
实验分组:取40只sd大鼠,随机分为5组,早期mscs治疗组(iic初次诱导时给予mscs移植)和晚期mscs治疗组(第2次iic诱导时给予mscs移植),同时设立空白对照组、早期cia对照组(iic初次诱导时给予生理盐水注射)和晚期cia对照组(第2次iic诱导时给予生理盐水注射)。mscs移植采用尾静脉注射,浓度为1×107/kg。
3. cia大鼠模型的评价:关节炎严重程度以平均关节炎指数(arthritis index,ai)评价【3】,0级:无红肿;1级:局限于足或踝关节的轻度红肿;2级:足趾至踝关节的轻度红肿;3级:足趾至踝关节中度红肿;4级:踝关节至整个腿红肿或关节畸形,活动受限。每爪4分,共计16分。
于实验结束时(第60天)处死大鼠,取膝关节和踝关节经固定、脱钙、石蜡包埋、连续切片,做关节病理苏木素-伊红(he)染色,显微镜下观察组织病理表现,由两位病理科医生参照takayanagi等【4】标准,采用“双盲法”进行关节病理评分,计分标准如下:根据炎症细胞浸润、侵蚀性血管翳、滑膜增生、软骨下骨质破坏程度4项指标,每项按轻重程度评为0~3分(0分:无改变;1分:轻度;2分:中度;3分:重度)。4项指标评分相加则为该大鼠关节炎总病理组织学评分。
4. elisa法检测血清vegf、tnf-α和il-17的细胞因子浓度:大鼠眼眶采血,留取血清,按elisa试剂盒操作说明检测vegf、tnf-α和il-17。波长450nm,单位pg/ml。
三、 统计学处理
数据以 s表示,采用excel2010和spss 17.0医学统计软件进行统计学处理,2组间比较用成组设计的两样本均数的t检验,2组以上样本均数间的比较采用单因素方差分析,相关性采用sperman相关分析。p<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.mscs的培养与鉴定
接种培养3d后,可见少量贴壁细胞,未见克隆形成,此时无法从形态上辨认mscs,3~6d时细胞生长较快,至6~8d时可见较多克隆出现,大小不一。细胞生长至80%~90%融合时,呈长梭形,按1:2传代培养。3代后细胞呈形态均一的成纤维细胞样。流式细胞术检测mscs细胞表面抗原,结果显示cd29阳性,cd45阴性,3代以后纯度可达98.4%。成脂诱导结束时,大部分mscs被诱导分化为脂肪细胞,油红o染色阳性。成骨诱导结束时,大部分mscs被诱导分化为脂肪细胞,alizarin 红染色阳性。
2. cia动物ai值
与正常对照组比,各实验组大鼠造模后的ai值,差异有统计学意义(p<0.05)。早期治疗组ai(5.75±0.46)与早期cia对照组(9±1.31)比较差异有统计学意义(p<0.05);晚期治疗组ai(7.0±0.76)和晚期cia对照组(8.75±0.89)比较差异有统计学意义(p<0.05);早期治疗组与晚期治疗组比较,ai值较低,足肿胀度较轻,差异有统计学意义(p=0.004)。
3. 关节病理he染色观察
空白对照组大鼠病理切片显示滑膜仅1~2层,无增生,无血管翳形成,未见炎性细胞浸润,关节表面光滑无破坏。模型组滑膜层明显增厚,并向关节腔内侵入,可见大量炎性细胞浸润及新生血管的形成。早期治疗组及晚期治疗组滑膜病变轻微,炎性细胞浸润相对较少,软骨破坏不明显。早期治疗组关节病理评分(2.0±0.0)较其对照组(8.3±1.4)明显降低,差异有统计学意义(p<0.05);晚期治疗组(3.5±0.5)较其对照组(7.0±1.1)差异有统计学意义(p<0.05)。早期治疗组关节病理评分(2.0±0.0)低于晚期治疗组(3.5±0.5),差异有统计学意义(p<0.05)。
4. 血清vegf、tnf-α、il-17水平
见表1。①早期cia对照组和晚期cia对照组vegf、tnf-α、il-17水平均明显高于空白对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。②早晚期治疗组ai、关节病理评分、vegf、tnf-α、il-17水平均低于其相应对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。③早期治疗组较晚期治疗组ai、关节病理评分、vegf、tnf-α、il-17水平低,差异有统计学意义(p<0.05)。相关性分析表明各模型组vegf、tnf-α、il-17水平均与ai、关节病理评分呈显著正相关(与ai分别为r=0.928,p<0.01;r=0.88,p<0.01;r=0.72,p<0.01。.与关节病理评分分别为r=0.94,p<0.01;r=0.95,p<0.01;r=0.62,p<0.01)。
表1 各组大鼠血清vegf tnf-α il-17水平比较
( ) pg/ml
组别 |
| 只数 | vegf |
| tnf-α |
| il-17 |
|
空白对照组 | 8 | 10.32±0.16 | 24.59±2.14 | 4.08±0.16 | ||||
早期cia对照组 | 8 | 21.88±0.69a | 43.60±1.81b | 6.35±0.10c | ||||
早期mscs治疗组 | 8 | 16.02±0.78dg | 28.19±0.85eg | 5.28±0.90fg | ||||
晚期cia对照组 | 8 | 21.92±0.70a | 43.57±1.78b | 6.93±0.57c | ||||
晚期mscs治疗组 | 8 | 18.32±1.23dh | 30.31±1.63eh | 6.06±0.88fh |
注:lsd法 abc分别与空白对照组比较p<0.05;def分别与早晚期对照组比较p<0.05;g与h比较p<0.05。
讨论
cia的病理表现与ra类似,发病的免疫学过程相似,是广泛用于研究ra的动物模型。
mscs是一类具有高度自我更新和多项分化潜能的干细胞,在不同的诱导条件下可分化为骨和脂肪等结缔组织【5】。mscs的表面标志具有非特异性的特征,因此其鉴别主要依据形态学、诱导分化及表面抗原标志相结合法进行综合分析判断。本研究培养的第3代细胞可诱导分化为脂肪细胞与骨细胞,且其非特异性表面标志cd29阳性,cd45阴性, 纯度达98.4%,说明培养的细胞为mscs。
mscs移植的大鼠皮肤、毛发和全身症状等均无异常。早期治疗组和晚期治疗组大鼠的关节红肿、活动受限、ai、关节病理评分等指标均较其相应对照组减轻。结果提示,mscs对cia有效,且早期输注mscs可以明显改善cia病情活动性。
ra是以小关节受累为主要表现的自身免疫性疾病,其滑膜类似肿瘤样生长,形成血管翳,破坏骨、软骨与周围组织。滑膜炎过度增生的滑膜细胞中以成纤维样滑膜细胞(fls)为主【6】。vegf、tnf-α和il-17在ra的滑膜炎症中有着非常重要的作用。ra滑膜组织中有许多促血管生成因子高表达,如vegf、转化生长因子β(tgf-β)、表皮生长因子等等,其中的vegf是滑膜炎症过程中的重要细胞因子,有实验表明在实验性关节炎动物及ra患者血清及滑液中vegf蛋白及其基因表达明显高于正常【7-8】。本实验从血清的蛋白表达水平的变化中发现:关节炎大鼠vegf的表达显著升高,并与大鼠关节的ai及病理评分呈显著正相关。
tnf-α是机体应激反应中出现最早、发挥核心作用的炎症细胞因子,他的出现可促进其他炎症因子的生成,导致细胞因子网络失调,与ra发病及病程进展关系密切,可以促进滑膜成纤维细胞的增殖和滑膜微血管的新生,形成ra特征性血管翳【9】。ra患者外周血单核细胞和关节滑膜的巨噬细胞能分泌tnf-α,使外周血和关节滑膜tnf-α增高,患者的炎性指标升高及关节的肿痛增加【10】。tnf-α在ra滑膜进展中通过以下三方面发挥作用:①促进炎性细胞的聚集和活化:激活血管内皮细胞,促使内皮细胞表达粘附分子,刺激炎性细胞流向关节,导致局部的炎症反应和血管翳生成。②tnf-α刺激滑膜软骨细胞和成纤维细胞产生基质金属蛋白酶,从而降解关节软骨、胶原纤维,从而引起关节炎症。③在tnf-α作用下,滑膜巨噬细胞可进一步分化为破骨细胞,加重关节炎症。本实验发现早、晚期治疗组的血清tnf-α水平较其相应对照组明显降低。相关性分析表明,模型组tnf-α水平与ai和关节病理评分呈显著正相关。说明tnf-α水平与关节炎症程度有明显关系。
il-17通过刺激细胞因子的分泌促进滑膜血管翳的形成,盛慧明【11】等认为il-17增高可以通过促进fls中cyr61蛋白和整合素的表达介导滑膜细胞增生。另外,il-17还通过诱导关节滑膜细胞和软骨细胞表达基质金属蛋白酶,刺激破骨细胞的生成和活化,从而导致骨和软骨的破坏【12】。本实验相关性研究表明,il-17的表达水平与ai及关节病理评分呈显著正相关。
本研究发现造模组较空白对照组vegf、tnf-α和il-17的含量均有升高,且vegf、tnf-α和il-17表达量与ai、关节病理指数分别呈显著正相关,提示vegf、tnf-α和il-17水平与滑膜炎症的程度有明显关系。mscs移植后vegf、tnf-α和il-17分泌量受抑制,关节滑膜炎症好转,表明mscs对cia滑膜增殖有效。
然而,影响滑膜增殖的因素不止上述三种因子,且各因子间的相互作用机制复杂,因此mscs移植后对其他相关因子的影响如何尚待进一步研究。此外,mscs移植对关节液中vegf、tnf-α和il-17的表达有何影响,也需进一步探讨。总之,异基因mscs移植对cia大鼠的关节炎症状、滑膜增殖及滑膜病理都有所改善,其可能的机制是通过下调血清中vegf、tnf-α和il-17的表达,发挥在体内的免疫调节作用而实现的。
-[1] 基金项目:上海交通大学医学院科技基金(09xj21074)
作者单位:201900,上海市,上海交通大学医学院附属第三人民医院风湿免疫科。
通讯作者:赵福涛,futaozhao@yahoo.com.cn