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- 核因子-B及基质金属蛋白酶在骨髓单个核细胞心肌移植后的变化及意义
- 作者:任崇雷|发布时间:2013-06-20|浏览量:1418次
核因子-kb及基质金属蛋白酶在骨髓单个核细胞心肌移植后的变化及意义
任崇雷1 高长青1 赵兴卉2 李力兵1 郭俊伟2 叶卫华1 刘志勇1
1解放军总医院心血管外科 全军心脏外科研究所;2军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室;北京 100853北京301医院心血管外科任崇雷
【摘要】 目的:研究核因子-kb(nf-kb)、基质金属蛋白酶(mmps)及其抑制因子(timps)在骨髓单个核细胞(bmmncs)心肌移植后的变化,探讨其在细胞移植影响梗死后心室重构的作用及意义。方法:成年杂种犬24只随机分4组:急性心梗对照组及移植组(心梗后1h),陈旧心梗对照组及移植组(心梗后4w)。心肌直接注射法行自体bmmncs移植,移植后6周处死动物取心肌标本,用逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)方法检测心肌中基质金属蛋白酶2和9(mmp-2、-9)mrna及基质金属蛋白酶抑制因子1和2(timp-1、-2)mrna的表达;心肌组织中抽提核蛋白用western免疫印迹法检测nf-kb的表达。结果: bmmncs心梗移植组心梗区及心梗周围区mmp-2、-9 mrna及nf-kb表达水平均较相应对照组降低,而timp-1、-2 mrna均较相应对照组增高。结论:bmmncs心肌移植可能通过抑制核蛋白nf-kb活化导致 mmps-mrna的表达减少及timps-mrna的表达增加从而抑制了梗死后心室重构过程。
关键词: 细胞移植;心室重构;心肌梗死;核转录因子;基质金属蛋白酶
基金项目:全军“十一五”重点课题资助项目(06g112)
通讯作者:高长青,e-mail: changqing.cabg@x263.net
changes and significances of nf-kb and mmp after bmmncs implantation in infarction myocardium in dogs
ren chonglei1, gao changqing1, zhao xinghui2, li libing1, guo junwei2, ye weihua1, liu zhiyong1.
1institute of cardiac surgery of pla, department of cardiovascular surgery, clinical division of surgery, chinese pla general hospital, beijing 100853, china; 2state key laboratory of pathgen and biosecurity, institute of microbiology and epidemiology, academy of military medical sciences, beijing 100071, china.
ren chonglei,m.d., attending physician, institute of cardiac surgery of pla, department of cardiovascular surgery, clinical division of surgery, chinese pla general hospital, beijing 100853, china. renchl70@sina.com
correspondence to: gao changqing, m.d., professor, institute of cardiac surgery of pla, department of cardiovascular surgery, clinical division of surgery, chinese pla general hospital, beijing 100853, china. changqing.cabg@x263.net
objective: to evaluate the changes of nuclear factor kappa b(nf-kb),matrix metalloproteinase(mmp)and tissue inhibitor of mmp (timp) after bone marrow mononuclear cells (bmmncs) implantation in infarction myocardium, and investigate the effects and significances of implanting bmmncs on post-infarction ventricular remodeling. methods: 24 dogs were equally randomized into four groups: ami-control group, ami-bmmnc group, omi-control group and omi-bmmnc group. autologous bmmncs were injected into infarct and peri-infarct myocardium for transplantation in ami-bmmnc group and omi-bmmnc group. the same volume of no-cells pbs was injected into the myocardium in ami-control group and omi-control group. at six weeks of bmmncs transplantation, the myocardial speciemens were harvested in infarct, peri-infarct, and non-infarct myocardium. the mrna expression of mmp-2, mmp-9, timp-1, timp-2 was detected by reverse transcription-pcr (rt-pcr). nuclear protein was extracted from myocardium for western blot to examine nf-kb. results: the mrna of mmp-2, mmp-9 in infarct and peri-infarc region after cell transplantation were lower than in control group, while the mrna of timp-1 and timp-2 in infarct and peri-infarc region after cell transplantation were higher than in control group. nuclear protein was extracted from myocardium for western blot, which showed the decrease of nf-kb in infarct and peri-infarc region after cell transplantation. conclusion: bmmncs implantation in infarct myocardium induces the down-regulation of mmp-2, mmp-9, the up-regulation of timp-1, timp-2, and the decrease of nuclear protein nf-kb. nf-kb and mmp may take part in the process of cell transplantation alleviating ventricular remodeling.
key words: cell transplantation; ventricular remodeling; myocardial infarction;myocardial infarction;matrix metalloproteinase; nuclear transcriptional factor
应用多种外源性细胞进行的细胞心肌成形术可以达到修复梗死心肌及改善心功能的效果,有着非常诱人的发展前景,目前已成为医学界重点研究的课题之一。已有研究【1-4】表明,骨髓干细胞能够修复受损心肌,改善不利的心室重构及恶化的心功能。我们此前的研究【5】也观察到骨髓单个核细胞移植梗死心肌后在形态、结构及功能方面阻止或逆转了梗死后心室重构的发展。但骨髓干细胞移植对梗死后心室重构影响的分子机制仍不清楚。本研究旨在通过观察骨髓单个核细胞在梗死心肌移植后核转录因子及基质金属蛋白酶的变化,探讨骨髓单个核细胞移植影响梗死后心室重构的可能分子机制,为临床实验及应用提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组:成年健康杂种犬24只(解放军总医院实验动物中心提供),犬龄1~3岁,均为雄性,体重16~18 kg。将24只犬采用随机数字表法随机分为4组:急性心肌梗死对照组(ami-control)、急性心肌梗死移植组(ami-bmmnc)、陈旧心肌梗死对照组(omi-control)和陈旧心肌梗死移植组(omi-bmmnc),每组6只。
1.2犬心肌梗死模型的建立:犬心肌梗死模型的建立参照文献【6】稍加改进,在全身麻醉下,左侧开胸,先用4-0 prolene线结扎通向预定梗死区的心脏表面冠状动脉侧枝,然后于第1、2对角支开口处之间用4-0 prolene线结扎左冠状动脉前降支主干。急性心肌梗死移植组和急性心肌梗死对照组在冠状动脉左前降支主干结扎1h,观察在缺血梗死区仍然呈暗红色,确认急性心肌梗死模型建立成功,可进行下一步细胞移植实验。陈旧心肌梗死移植组和陈旧心肌梗死对照组在移植前行超声心动图检查证实左室前壁和心尖部可见节段性室壁运动异常,确认陈旧心肌梗死模型建立成功,可进行下一步细胞移植实验。
1.3犬骨髓单个核细胞的分离及移植:细胞移植前1d,局麻下于髂后上嵴采集犬自体骨髓8~10 ml,采用ficoll分离法【7】获得骨髓单个核细胞,于37℃、5%co2孵箱过夜。次日细胞移植前1h,收集细胞,悬于5ml磷酸盐缓冲液(pbs),冰盒保存运至手术室用于细胞移植。细胞移植采用直视下心肌注射法:急性心肌梗死移植组在心肌梗死模型建立成功后1小时移植,取分离好的骨髓单个核细胞悬液于左室前壁和心尖部的梗死区及梗死边缘区行多点心肌内全层注射,每点注射0.5ml,共注射10个点,其中梗死区4个点,梗死边缘区6个点。陈旧心肌梗死移植组于心肌梗死模型建立后4周,再次开胸,暴露心尖部和左心室前壁,确认梗死区,移植方法与急性心肌梗死移植组相同。急性心肌梗死对照组及陈旧心肌梗死对照组均以同样的方法注射等体积的无细胞的pbs液。
1.4取材:各组动物饲养至细胞移植后6周,在全身麻醉下再次开胸,记录心电图并行血流动力学测量后,心内注射15%氯化钾10ml使心脏停搏于舒张期,迅速取下心脏,以生理盐水冲洗干净,分别于梗死区、梗死周围区和非梗死区留取心肌组织标本。置入液氮罐冷冻保存备用。
1.5 rt-pcr方法检测心肌组织中mmp及timpmrna的表达:取液氮冻存的心肌标本50mg研磨成匀浆,提取总rna,测定rna浓度,合成cdna模板。检测目的基因4个:基质金属蛋白酶-2(mmp-2)、基质金属蛋白酶-9(mmp-9)、基质金属蛋白酶抑制因子-1(timp-1)、基质金属蛋白酶抑制因子-2(timp-2),内参照基因为b-actin。利用设计(表1)并合成好的pcr引物(invitrogen biotechnology co. ltd)建立10μl反应体系,以b-actin作为内参照来调整模板浓度一致,置入pcr仪行pcr扩增,设定反应条件:94℃变性30 min,用94℃变性30 s,退火30 s, 72℃延伸45 s, 循环35轮,不同基因退火温度见表。pcr扩增产物行琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统观察拍照,用band scan图像分析软件对电泳条带灰度值进行定量分析,用b-actin进行校准后得到心肌标本中每个目的基因mrna的相对含量。
1.6 western blot 检测心肌组织中核转录因子nf-kb的表达:取70-100mg液氮冻存的心肌样本抽提核蛋白,bradford法蛋白定量,先后经上样电泳、转膜电泳、丽春红染色、封闭、一抗nf-kb/p65多克隆抗体(1:400,santa cruza)孵育、羊抗兔igg二抗(1:2000,北京中杉生物技术公司)孵育,使用pierce化学发光试剂,暗室内压片,显影,定影,显色。以b-actin多克隆抗体(1:400)为阳性对照。将western blot的照片输入图像扫描仪,用band scan图像分析软件对其总灰度值量化,用b-actin进行校准后得到心肌标本中nf-kb的相对含量。
1.7 统计学方法:计量资料采用均数±标准差(x±s)表示, 所有数据应用chiss统计软件进行统计学分析处理,组间计量资料比较采用t或t'检验,组内计量资料比较采用单因素方差分析,p<0.05为差异有统计学意义。
表1 目的基因及内参照基因pcr引物序列表
基因 | 基因库序列号
| 引物序列 (5´?3´)
| 产物 大小 (bp) | 退火 温度 ( ˚c) | 循环数 |
mmp-2 | af177217 | f: aactacaacttcttcccccga r: gggaacttgcagtactctcc | 382 | 55 | 35 |
mmp-9 | af095824 | f: gagtttcgacgtgaagacgcagac r: caaaggtcacgtagcccacttcgt | 200 | 55 | 35 |
timp-1 | ab016817 | f:gcgttatgagatcaagatgac r:ctggtccgtccacaagca | 345 | 50 | 35 |
timp-2 | nm_0010003082 | f:gcagatgtagtgatcagggc r:gtttaggctcttcttctggg | 315 | 50 | 35 |
b-actin | nm_001003349 | f:catcctgcgtctggacctg r:tagctcttctccagggagg | 200 | 58 | 35 |
2 结 果
2.1 骨髓单个核细胞移植基本情况:急性心肌梗死移植组行细胞移植时,有室性早搏和低血压出现,经对症处理后,均完成计划移植细胞量[(8.0±2.3)×107个];陈旧心肌梗死移植组行细胞移植时,无明显的心电图和血压变化,均顺利完成计划移植细胞量[(7.6±1.6)×107个]。上述两组无细胞移植所致的并发症和死亡。
2.2 细胞移植后心肌组织中mmpmrna的表达变化:对照组心梗区及非心梗区mmp-2和mmp-9 mrna水平均较非心梗区明显升高,急性及陈旧心梗细胞移植组心梗区及心梗周围区mmp-2和mmp-9 mrna水平均较相应对照组降低,而非心梗区无明显差异,见图1。
2.3 细胞移植后心肌组织中timpmrna的表达变化:对照组心梗区及非心梗区timp-1和timp-2 mrna水平均较非心梗区降低。急性及陈旧心梗细胞移植组心梗区、心梗周围区及非心梗区timp-1和timp-2 mrna水平均较相应对照组升高,见图2。
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图1 rt-pcr检测的各组心梗犬心肌组织中mmpmrna的表达及半定量结果
注:*表示与相应对照组比较p<0.05,以下各图同。
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图2 rt-pcr检测的各组心梗犬心肌组织中timpmrna的表达及半定量结果
2.4 细胞移植后心肌组织中核转录因子nf-kb的表达变化:对照组心梗区及非心梗区nf-kb核蛋白水平均较非心梗区增高。急性及陈旧心梗细胞移植组心梗区、心梗周围区nf-kb核蛋白水平较相应对照组降低,而在非心梗区则较相应对照组增加,见图3。
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图3 western blot检测的各组心梗犬心肌组织中nf-kb的表达及半定量结果
3 讨论
心室重构是ami后发生慢性心力衰竭的主要病理基础,是心肌梗死后心力衰竭及死亡的最主要原因,通过减缓或抑制不利的心室重构过程可以改善心肌梗死后心脏的功能【8-11】。大量研究表明,mmps的表达和活性的增加以及timps抑制作用的减弱在心肌梗死后心室重构过程中具有重要作用【12-14】。shake【3】等研究表明骨髓干细胞移植后可以改变心室重构过程中胶原酶的活性,从而增加心室收缩时梗死部位心肌的变厚程度,有利于心功能的恢复。本研究通过rt-pcr的方法检测了骨髓单个核细胞移植后梗死心肌中mmps 及timps在基因水平的变化,结果表明,在两个对照组心梗区及非心梗区mmp-2和mmp-9 mrna水平均较非心梗区升高,而timp-1和timp-2 mrna水平表现出相反的变化,较非心梗区降低。骨髓单个核细胞移植后,不管是在急性心梗期还是在陈旧心梗期,心梗区及心梗周围区mmp-2和mmp-9 mrna水平均降低,而timp-1和timp-2 mrna水平增高。这提示在梗死后心肌组织中,通过mmps的上调及timps的下调调节了胶原为主的细胞外基质成分的变化,影响了梗死后心室重构的病理过程;而骨髓单个核细胞移植的移植则抑制或逆转了这种变化,表现为mmps的下调及timps的上调,继发引起胶原量的减少,从而阻止或逆转了心室重构的发展。
核转录因子作为信号转导途径中的一环,负责细胞内的信息交流及综合,作用于胶原基因的调控,在组织器官纤维化形成中有意义。nf-kb是最重要核转录因子之一,其作为信号转导途径中的枢纽,与多种生理、病理作用有关。nf-kb是静息状态下以失活状态存在于细胞质中,在外界因素刺激下,nf-kb得以激活并移位进入细胞核,启动基因转录【15】。有研究证明,在心脏重构中起中心作用的mmp-2和mmp-9,其转录直接由nf-kb调控【16,17】,在梗死后重构过程中,通过抑制nf-kb,直接或通过抑制炎症反应间接导致mmp-2, -9表达的减少,对细胞外间质重构起有益的作用【14】。本研究通过提取核蛋白,应用western blot方法检测了梗死后心肌中nf-kb的表达,结果发现,在对照组心梗区及心梗周围区nf-kb核蛋白水平均较非心梗区增高,提示,心梗区或心梗周围区nf-kb上调,参与了不利的梗死后重构过程,而在骨髓单个核细胞移植后,心梗区及心梗周围区nf-kb水平均降低,以陈旧心梗期移植组更为明显,说明,骨髓干细胞移植后,抑制了nf-kb的表达,从而导致mmp-2, -9表达的减少,而对细胞外间质重构起有益的作用。陈旧心梗期移植组下调变化显著,也说明在陈旧心梗期排除了急性期炎症因素的影响后,nf-kb的变化更明显。骨髓单个核细胞移植后,nf-kb在非心梗区的上调,可能与心肌细胞肥大、凋亡及缺血等多种因素有关,具体机制尚不好解释。
骨髓单个核细胞在梗死心肌移植后, mmps基因及核蛋白nf-kb表现为下调,而timps表现为上调。结合文献,我们推测骨髓单个核细胞影响梗死后心室重构的可能分子学机制:骨髓单个核细胞心肌移植后,可能通过抑制nf-kb由细胞核外移至核内的激活,从而抑制mmps基因的转录,mmps降低通过负反馈机制引起timps的增加,最终导致胶原等细胞外基质的变化,抑制了胶原的合成及沉积,从而阻止了梗死后心室重构的发展过程。本研究不足之处在于仍局限于骨髓单个核细胞心肌移植后影响梗死后心室重构的现象观察,缺乏对其影响机制的直接因果推断。方法学发展将有助于进一步阐明骨髓单个核细胞阻止或逆转梗死后心室重构的分子学机制。
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