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- 陈振光主任医师
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医院:
中山大学附属第一医院
科室:
胸外科
- 肺癌化疗药物抗药标志
- 作者:陈振光|发布时间:2012-06-22|浏览量:904次
目前肺癌的发病率和死亡率呈上升趋势,化疗是肺癌的治疗支柱之一,如何选择预测相对敏感的药物,避开预测相对耐药的药物成为提高疗效的关键。随着以药物敏感相关标志为检测目标的药物基因组学和药物遗传学的发展,使个体化的药物治疗成为可能。个体化治疗是根据患者遗传学特点使用特异的对其最佳的化疗药物,以提高化疗的敏感性及延长中位生存时间,同时将毒副反应降到最低。中山大学附属第一医院胸外科陈振光
1抗微管药物相关的分子标志
1.1p微管蛋白(13一tubulin)微管是有丝分裂中纺锤体的组成部分,它的聚合和解聚是细胞有丝分裂时染色体分离所必需的。a微管蛋白与p微管蛋白先结合成二聚体,然后组装成微管,微管与微管蛋白处于动态平衡中,会因代谢条件的改变而解聚或解体,因此许多抗有丝分裂的药物通过和a/p微管蛋白异二聚体或微管相互作用而发挥疗效。抗微管药物分为两大类:一类是促进微管聚合的药物(紫杉醇类药物)如紫杉醇和多西紫杉醇,另一类是促进微管解聚的药物(长春碱类药物),如去甲长春花碱。紫杉类药物主要作用机制是与微管聚合体结合,促进微管蛋白聚合,抑制微管蛋白解聚,其诱导形成的微管相当稳定,从而阻止了微管的动态重组过程,使细胞增殖阻滞于G/M期,进而阻断细胞增殖,引起细胞死亡;长春碱类药物的主要作用机制则是对微管的破坏作用,尤其是对形成有丝分裂纺锤体的微管,能干扰微管蛋白聚合。
微管的代谢受tubulin亚型的影响。Haber等[1]认为,尽管还未完全阐明p微管亚基的功能,但可以肯定各种微管蛋白在微管动力学和与药物的结合中起着不同的作用。现知促微管聚合类药物紫杉醇耐药产生的主要的机制除多药耐药基因一1的大量表达外,还有a?tubulin和~-tubulin基因点突变的显著表达及f}_tubulin同型的选择性高表达。
Rosell等[2]在研究中发现,影响紫杉醇活性的微管突变率为2O%,且突变主要发生在102?264密码子周围,这一密码子与三磷酸鸟苷(guanosinetriphosphate,GTP)和紫杉醇B微管结合点关系密切。有研究发现紫杉醇耐药的部分患者中p微管蛋白基因改变,中位生存期较p微管蛋白基因无突变者显著降低。Monzo等[4为明确p微管蛋白基因突变与紫杉醇耐药的相关性,研究了49例紫杉醇化疗后的NSCLC患者的活检标本,发现16例存在p微管蛋白基因突变,同样也无1例对化疗有效。在33例没有p微管蛋白基因突变的患者中13例获完全或部分缓解。因此可将B微管蛋白基因突变作为紫杉醇类药物一个重要的耐药分子指标。
体外实验证实,B微管同型表达的改变与紫杉醇耐药有关。在人类细胞存在着7种p微管蛋白同型(I、Ⅱ、Ⅲ、IVa、IVb、V、VI),这些微管蛋白同型同属于一个高度同源的蛋白质家族,它们之间的差别仅在于4~16氨基酸序列的不同,主要集中于C末端的最后15个氨基酸残基,其次存在于35.55-57和124位氨基酸残基。目前对紫杉醇类药物耐药与微管蛋白同型表达改变的相关性进行了很多研究,耐药的产生几乎涉及各个同型[5],结果也不完全一致。Monzo等[4]发现?tubulinI第四外显子的突变与紫杉醇类药物耐药密切相关,与预后差成正比。然而最近的研究却不支持这一观点,认为用外显子引物扩增时有87的突变率;用内含子引物扩增时,这些改变全消失了;从而推断用外显子引物扩增的产物会出现?tubulin假基因,因此~tubulinI突变与紫杉醇耐药的关系需进一步证实。各种研究表明6-tubulinⅡ不是细胞耐药的主要因素。?tubulinⅢ表达与作用于微管类的药物化疗敏感性显著相关,在个体化疗方案制定中起重要作用。在用反义寡核苷酸抑制A549耐药细胞?tubulinⅢ编码基因,减少[3-tubulinⅢ表达后发现,可部分(39)恢复对紫杉醇的敏感性。Dumontet等[6在临床对19例NSCLC患者6一tubulinⅢ表达与预后关系的研究中发现,f}-tubulinⅢ高水平表达患者的无病生存期(41天)明显低于f}-tubulinⅢ低表达者(288天,P一0.02)。在9例高表达f}-tubulinⅢ患者中仅有2例对化疗敏感(22),而低水平表达的患者中化疗敏感率为6O。吴一龙等[7在一项关于辅助化疗的Ⅲ期临床随机对照试验(CSLC0201)中,探讨了6-tubulinⅢ在预测NSCLC术后辅助化疗疗效中的价值,患者均为完全性切除的NSCLC,术后辅以多西紫杉醇/卡铂4周期化疗。结果显示,?tubulinⅢ阳性组的中位无复发时间仅为6个月,阴性组为26个月(P一0.006);在辅助化疗无效组,66.7出现6-tubulinⅢ阳性表达,明显高于辅助化疗有效组(14.3,P一0.063)。所以,p?tubulin的7种异构体中只有?tubulinⅢ才是紫杉醇类药物耐药的惟一标志物。但是关于同型改变与耐药的关系,目前也只是观察到其在耐药细胞中有改变,而对其具体作用机制却知之甚少。推测其可能机制是一tubulinⅢ表达增加,微管的动态不稳定性增加,或者由于该同型对紫杉醇不敏感所致。目前,促微管解聚类药物(长春碱类)耐药与同型表达改变的关系众说不一,结果相差悬殊。
1.2o【微管蛋白(o【一tubulin)Han等JWesternblot的分析结果发现,人肺癌耐药细胞株(H460/T800)中a和亚基都比敏感株表达高。将反义人KalcDNA转染人耐药株中,细胞出现a基因的低表达,与未转染细胞相比,转染细胞对紫杉醇细胞的耐药性提高了45~51,说明a?tubulin的改变也是紫杉醇耐药的机制之一。
1.3极光激酶(Aurora)Aurora激酶家族是一组新近发现的调节中心体和微管功能的丝/苏氨酸激酶,对有丝分裂的正常进行起着至关重要的作用啪。Aurora?A是Aurora激酶家族的重要成员之一,其编码基因定位于20q13.2,许多恶性肿瘤在这一区域出现异常的扩增,如大肠癌、乳腺癌、膀胱癌和卵巢癌等。由于新近发现许多恶性肿瘤Aurora?A高表达,体外实验研究亦发现Aurora?A高表达可以诱发正常细胞的恶性转化,因此这一基因已被确认是一种新的癌基因。有许多资料表明不同肺癌细胞Aurora?A基因表达水平差异有显著性。此基因参与微管的代谢,其过表达导致着丝粒的扩增,参与紫杉醇耐药。
1.4StathminStathmin是一种新发现的微管不稳定蛋白,在细胞周期的不同阶段通过磷酸化和去磷酸化作用对细胞微管系统动力平衡的调节发挥十分重要的作用:有丝分裂间期,Stathmin蛋白处于非磷酸化状态,促进微管解聚。有丝分裂早期,Stathmin蛋白磷酸化,有丝分裂纺锤体形成。有丝分裂后期,Stathmin蛋白去磷酸化,有丝分裂纺锤体解聚,退出有丝分裂。到下一个分裂间期,微管重新聚合,当进入有丝分裂重新解聚[1。。。其磷酸化作用调节细胞的增殖和分化,对于细胞外信号起一个中继站的作用,故命名为Stathmin,来自于希腊语stathmos(relay)。现已证实,Stathmin蛋白具有解聚微管的作用,当其表达增加时,减少微管的聚合,使纺锤体无法形成;当其表达减少时,增加微管聚合,抑制微管解聚而抑制细胞分裂。通过对几种肺癌细胞的研究表明,微管的聚合状态能够影响其与化疗药物的结合。增加微管的聚合状态能够增加紫杉醇与微管的结合,减少长春碱与微管的结合。Stathmin蛋白过表达能够促进微管解聚,其表达与肺癌细胞对长春地辛敏感相关,可作为肺癌患者对长春碱类药物敏感的标志[】。Alli等[】发现Stathmin的过表达干扰了紫杉醇与微管的结合,却增加了长春碱类药物与微管的结合,因此Stathmin的过表达降低了患者对紫杉类药物的敏感性,却增加了长春碱类药物的敏感性。
2抗DNA拓扑异构酶抑制剂相关的分子标志
DNA拓扑异构酶I(DNAtopoisomeraseⅡ,DNATopoⅡ)通过催化DNA双链的断裂而改变空间结构,降低ATP与酶结合的能力,影响染色体分离、基因重组和转录及DNA损伤与修复,其效能大于DNA拓扑异构酶I。TopoⅡ既是某些细胞毒药物作用靶点,又是MDR的重要靶酶,介导多种化疗药物的MDR。由于肿瘤细胞具有快速增殖的特性,其TopoⅡ的含量及活性远远高于正常体细胞,因而抑制TopoⅡ活性能阻止肿瘤细胞快速生长增殖,进而杀死肿瘤细胞。除此之外,TopoⅡ抑制剂也可通过增加裂解复合物的稳定性来影响癌细胞的增殖,造成细胞凋亡。虽然它们的作用机制不尽相同,但都是以在细胞生命过程中起重要作用的TopoⅡ为作用靶点[133。故肿瘤对此类化疗药物的敏感性取决于TopoⅡ的水平,高水平的TopoⅡ表达是药敏的基础,TopoⅡ水平下降,肿瘤对化疗药物的敏感性下降,耐药性增高。用人NSCLC细胞系SW一1573分析TopoⅡ的变化与肺癌耐药的关系,发现在耐药细胞中TopoⅡ数量和活性降低,推测肺癌耐药的产生与TopoⅡ数量减少和(或)活性降低有关。
3抗吉西他滨相关的分子标志
核糖核酸还原酶(ribonucleotidereductase,RR)是细胞DNA复制及损伤修复过程中提供二磷酸核苷(deoxyribonucleosidediphosphate,dNDP)的唯一酶类,因此是DNA合成通路中的限速酶,它能逆转二磷酸核苷酸为二磷酸脱氧核苷酸。RR基因有两个亚单位RRM1(ribonucleotidereductasesubunitM1)和RRM2(ribonucleotidereductasesubunitM2),其中RRM1基因编码核糖核苷酸还原酶M1亚单位,是肿瘤抑制基因,能抑制肿瘤转移,也是吉西他滨(gemcitabine,Gem)的分子靶点。75的NSCLC患者有异质性缺失,这种异质性缺失与患者预后差成正比[1幻;M2亚单位携带接触抑制区,控制底物转化。体外研究表明,RRM1mRNA过表达在RNA和蛋白质两个水平诱导PTEN表达,阻止细胞迁移、浸润和转移,使PTEN靶向基因的磷酸化减少。动物实验表明,RRM1mRNA过表达减少细胞迁移和浸润,从而抑制转移,延长生存时间。对肿瘤组织和正常肺组织中RRM1mRNA和PTENmRNA进行实时定量PCR测定表明,病灶可切除患者中RRM1mRNA和PTENmRNA水平升高与其生存期延长明显相关。回顾性分析中发现RRM1mRNA过表达对Gem耐药,接受过Gem和顺铂(cisplatin,DDP)联合治疗的NSCLC患者,体内低R.RM1mRNA水平与生存时间成正比。也有研究表JournalofPracticalOncologyVo1.23No.12008明,hRRM2而不是hRRM1的过表达在Gem的耐药过程中起着重要作用。细胞对Gem的耐药伴有RR活性增高和hRRM2mRNA与蛋白的过度表达。但具体耐药机制尚不十分清楚。总之,RR的高表达是Gem耐药的标志物,可为肺癌患者指导临床用药。
4抗铂类药物相关的分子标志DDP被认为是治疗NSCLC最有效的单药,在联合用药方案中也是必不可少的。它含有类似烷化剂的双功能基团,与细胞内亲核基团结合,无选择地分布在肿瘤组织中。其抗癌作用的主要靶点为DNA,与细胞DNA的碱基相互作用形成泡状链内铂一DNA加合物,引起DNA复制障碍,抑制癌细胞分裂;此外,泡状链内铂一DNA加合物能激活多条信号通路,诱导细胞发生凋亡。铂类耐药是由多种因素引起,包括药物积聚减少;药物解毒增加(如谷胱甘肽和金属硫蛋白);DNA损伤修复能力(DNArepaircapacity,DRC)增强及铂类DNA加合物增加等。其中肿瘤细胞DNA加合物的修复异常将削弱凋亡过程,产生对顺铂耐药。DRC改变是铂类耐药的重要的分子基础[1引,DNA损伤修复有4种基本形式,即碱基切除修复(baseexcisionrepair,BER)、核苷酸切除修复(nucleotideexcisionrepair,NER)、酶修复和双链断裂修复。
4.1切除修复交叉互补基因(excisionrepaircross?complementarygene1,ERCC1)ERCC1是NER组成成分,参与DNA损伤识别和DNA链的切割。ERCC1过表达可使停滞在G/M期的损伤DNA迅速修复,导致其对顺铂耐药。ERCC1共有4种分子量的mRNA,但只有llkb的mRNA表达出分子量为39×10‘的蛋白时,才表现为对药物耐药。用反义技术抑制ERCC1表达可以减少DDP-DNA加合物的修复[1副。Simon等[163采用RT?PCR法检测了未接受化疗患者NSCLC瘤内ERCC1mRNA相对表达水平,发现ERCC1表达与患者预后呈正相关,即高表达患者的中位生存期显著长于低表达患者。Lord等[1]在56例晚期NSCLC患者中探讨ERCC1表达与含铂类药物化疗的关系。发现ERCC1表达程度与患者生存期呈负相关,高表达的生存期明显低于低表达者(分别为20.4周与61.6周,P一0.01),在多因素预后分析中ERCC1高表达是独立危险预后因子。2006年ASCO会议中Soria采用标准的免疫组化方法,检测了国际肺癌临床试验(IALT)人组的783例手术切除的NSCLC患者肿瘤组织中ERCC1的表达情况,结果显示,783例中761例标本符合分析条件。335例患者(44)的ERCC1阳性,含顺铂方案辅助化疗受益与ERCC1状态有关(P<0.009)。ERCC1阴性的患者随机接受辅助化疗明显延长生存时间,降低死亡风险。因此认为未接受化疗患者,ERCC1表达水平与预后呈正相关,而接受含铂类药物化疗患者,ERCC1表达水平与预后呈负相关,NSCLC根治术后肿瘤组织中ERCC1检测阴性的患者可以从含顺铂的辅助化疗中明显获益。
4.2X线修复交叉互补基因(X?rayrepaircross?complementrygene,xRCC1)XRCC1基因是一种DNA修复基因,它主要参与DNA损伤修复反应中的BER和单链断裂修复过程。XRCC1多态性可能影响DRC,由于存在着单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP),不同个体的XRCC1活性不同,这可能是导致个体间修复能力差异的分子基础。而铂类的作用机制在于对肿瘤细胞DNA造成损伤,损伤后的DNA如果能够及时修复,则会导致铂类药物的耐药。因此个体DNA损伤修复能力的差异可能是决定铂类药物疗效的重要因素[1引。XRCC1Argl94Trp和Arg399Gln两个位点的多态性可能会影B~XRCC1蛋白的正常功能,降低DNA修复能力,从而影响铂类药物的化疗敏感性。
4.3着色性干皮病基因(xerodermapigmentosumD,XPD)又称作ERCC2基因,位于染色体19q13.2?13.3,编码解旋酶,发挥5一3解旋酶活性,是转录因子(transcriptionfactorⅡH,TFⅡH)的组成部分,NER途径的必需成分。XPD的多态性可以改变DRC,与铂类药物的敏感性密切相关。目前还不清楚XPD的多态性影响化疗疗效的原因c1。现发现XPD的几种多态性与DRC有关,该基因第312位密码子G?A多态和第751密码子C?A多态分别导致Asp312一Asn312和Lys751一Gln751氨基酸替代,这两个多态位点不但存在连锁不平衡,而且其突变表型与DRC密切相关。Hemmink等[2叼报道,携带312Asn/Asn和751Gin/Gin的个体修复嘧啶二聚体的能力比野生基因型低5O,也就是说DRC低,即对铂类药物的化疗敏感性增高。