恶性胶质瘤组织中Bcl-xL mRNA和蛋白的表达以及与临床病理的关系

 摘  要: 目的  探讨恶性胶质瘤细胞中Bcl-xL mRNA和蛋白的表达及其与临床组织病理因素的关系。方法  用免疫组化染色SP法和RT-PCR检测89例恶性胶质瘤组织（恶性星形细胞瘤AA44例，胶质母细胞瘤GNB45例）和20例正常人脑组织中Bcl-xL mRNA和蛋白的表达。结果  恶性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤组织中Bcl-xL蛋白的阳性率（/44  87.0% 和/45  92.8%）均显著高于正常人脑组织中4/20（P＜0.01），恶性星形细胞瘤组和胶质母细胞瘤组Bcl-xL蛋白的阳性率差异无意义（P＞0.05）；恶性星形细胞瘤和胶质母细胞瘤组织中Bcl-xLmRNA相对含量均显著高于正常脑组织（P＜0.01），同时胶质母细胞瘤组织中Bcl-xLmRNA相对含量高于恶性星形细胞瘤（P＜0.05）。结论  恶性胶质瘤细胞中普遍存在Bcl-xL mRNA和蛋白高表达，Bcl-xL mRNA的高表达与临床病理分级呈显著正相关系，其高表达可能与胶质瘤的恶性进展存在密切关系。郑州大学第五附属医院神经外科王新军

关键词：恶性星形细胞瘤；胶质母细胞瘤；Bcl-xL；基因表达

Expression  of  bcl-2  mRNA and  protein  in  Human  Glioma

Wang Xin-jun¹ Department of Neurosurgery,Zhengzhou Railway Central Hospital, Zhengzhou  450052 , China;

Abstract: Objective  To study the correlation of bcl-2 gene expression level with the prognosis in human glioma. Methods  The expression of bcl-2 protein and bcl-2 mRNA were determined by immunohistochemical staining method and in situ hybridization in 61 samples of  human glioma tissues, as well as 20 normal brain tissues. Results  The positive rates of bcl-2 protein(90.2%) and bcl-2 mRNA (95.1%) in glioma group was significantly higher than those in human normal brain tissues (P<0.01), and a significant correlation was found between bcl-2 protein and bcl-2 mRNA expression level , between bcl-2 expression level and pathological grading(P<0.01). Conclusion  High bcl-2 expression was prevalent in malignant glioma tissure,and the bcl-2 expression level was a close correlation with the clinical prognosis.

Key words: Glioma；bcl-2；immunohistochemical ；in situ hybridization ；prognosis

0  引言

Bcl-xL基因是bcl-2家族中重要的凋亡抑制基因，位于细胞线粒体膜上，主要通过稳定线粒体膜电位，阻止细胞色素C和凋亡抑制因子的释放，阻断Caspase酶活化的上游信号传递通路等作用，打破细胞的自稳平衡机制，使得受损或突变细胞不能得到及时清除，并在增生基因和生长抑制基因的协同作用下，导致细胞恶变，最终发展为肿瘤^[6]。研究表明，多种肿瘤组织中都存在bcl-xL的高表达，它的异常表达可使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡，与肿瘤的发生恶性进展有关^1，5]。  为了进一步了解恶性胶质瘤组织中Bcl-xL基因的表达以及与组织病理的关系，本研究检测了恶性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤和正常脑组织中Bcl-xL基因的表达本研究采用免疫组化和原位杂交的方法来探讨胶质瘤中bcl-2表达，以探讨Bcl-xL在恶性胶质瘤的恶性进展中作用，进而为恶性胶质瘤的诱导分化治疗提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 病例与组织标本

选择我院2003年1月到2005年12月手术切除的新鲜胶质瘤标本89例，病理证实均为恶性胶质瘤,其中男62例，女27例，年龄18～69岁，平均41.1±8.9岁。根据WHO新病理分级，Ⅰ级10例，Ⅱ级9例，恶性星形细胞瘤Ⅲ级44例，胶质母细胞瘤Ⅳ级45例。另随机选取20例同期颅脑损伤患者手术获得的无神经系统肿瘤的正常脑组织标本作正常对照,对照组男性16例，女性4例，年龄21～51岁，平均37.9±4.2岁。标本收集时，取中心无出血坏死部分,一份液氮中冻存;另一份40g/L多聚甲醛中固定。

1.2  试剂及引物
 一步法RT-PCR试剂盒购于宝生物工程有限公司。Bcl-xL引物序列：上游：5’-CCCAGAAAGGATACAGCTGG-3’; 下游：5’-GCGATCCGACTCACCAATAC-3’扩增片段为448bp。β-actin参引物序列：上游：5’-ATGTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’; 下游：5’- CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC-3’， 扩增片段为512bp以上引物均由北京奥科生物工程公司合成。

1.3 实验方法

1.3.1 组织中总RNA提取  取50mg左右冻存组织标本至匀浆器中加入1mlTrizol快速研磨，将匀浆液转移到无菌、RNase-free的1.5ml离心管中，用吸头反复吹打，振荡后室温静置5min。其余实验过程严格按照TRIzol试剂所附的说明要求操作进行。最后将所得RNA样品5μl溶于60μlDEPC稀释水中，用紫外分光光度法定量RNA.

1.3.2一步法RT-PCR扩增检测Bcl-xL mRNA

在25μl的扩增体系中分别加入10x一步法RT-PCR缓冲液2.5μl、25mmol/L MgCl₂5μl、10mmol/LdNTP2.5μl,RNA酶抑制剂0.5μl，AMV逆转录酶0.5μl，bcl-xL上下游引物及内参β-actin上下游引物各1μl,实验样品RNA 1μg，DEPC水25μl。RT-PCR扩增反应条件：50℃ 30min进行RT反应，94℃ 2min灭活RNA酶；变形94℃ 30s,复性58℃30s,延伸72℃ 1 min,共进行30个循环。 取6μlPCR扩增产物在1%的琼脂凝胶中进行电泳1h，紫外线透视仪下观察结果，并用凝胶成像仪分析系统测定灰度值，计算Bcl-xL/β-actin的比值，获得目的片段的相对含量。

1.3.3 Bcl-xL蛋白的免疫组织化学染色

兔抗人bcl-xL蛋白多克隆抗体购于博士德生物工程公司，SP法免疫组织化学染色试剂盒购于武汉博士德生物工程公司。实验过程严格按照随试剂所附的说明要求操作进行。组织切片经常规脱蜡、水化后，放入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中预处理，经微波加热（92～98℃）10 min，冷却到室温后用单克隆Ⅰ抗SP 法标记bcl-2蛋白（1∶60）。用已知阳性表达切片做阳性对照，用正常羊血清代替一抗作阴性对照。结果判定：背景无颜色，胞浆内着棕黄色颗粒为阳性细胞。（?）没有阳性信号；（?）弱阳性，阳性细胞＜25%；（??）弱阳性，阳性细胞介于25%-50%；（???）强阳性，阳性细胞50%-75%；（????）强阳性，阳性细胞＞75%。

1.4 统计学处理

采用SPSS10.0软件对相应数据进行Ⅹ²检验、t检验、q检验及方差分析,以α=0.05作为检验水准。

 

2  结果

2.1 不同组织标本中Bcl-xL蛋白的表达

     Bcl-xL蛋白染色定位于细胞浆内，为棕黄色颗粒。恶性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤及正常脑组织中Bcl-xL蛋白的表达情况见图1和表1。

表1  Bcl-xL蛋白在正常脑组织及胶质瘤组织中的表达

Table1  Expression of Bcl-xL protein in normal brain tissue and Glioma tissue

                                                           

组  别       总例数  阴性数           阳性数           阳性率（%）

                                 +       ++     +++                

正常脑组织(A)      20      32     19        6        3        46.67

胶质母细胞瘤(B)    45      4       0        1        55       93.33

恶性星形细胞瘤(C)  44      0       1        1        12       100.00

注：A:B,A:C,P<0.01；B:C, P>0.05

2.2 不同临床病理组织中Bcl-xL mRNA的表达

RT-PCR检测结果见图2，由图2可以看出，内参为502bp的条带，目的基因Bcl-xL mRNA为448bp的条带。Bcl-xL mRNA的相对含量详细见表2。

表2  Bcl-xL mRNA的RT-PCR检测结果（mRNA相对表达量）

Table 2  Detection results of Bcl-xL mRNA by RT-PCR

                                                         

    组   别                 n           mRNA相对表达量   

正常脑组织              20          0.78±0.23       

胶质母细胞瘤            45          0.93±0.16       

恶性星形细胞瘤C组      44          0.98±0.14       

                                                         

注：胶质母细胞瘤与恶性星形细胞瘤组与正常脑组织两两相比，均P<0.01，但胶质母细胞瘤与恶性星形细胞瘤组P>0.05; 正常脑组织。

 

 

 

                       

  

图1正常脑组织（A）、恶性星形细胞瘤(B)及胶质母细胞瘤组织(C)中Bcl-xL蛋白的表达（SP法,DAB染色，苏木素复染，×400）

  M     A    B    C

图2 正常脑组织、恶性星形细胞瘤及胶质母细胞瘤组织中Bcl-xL mRNA的表达

M:Marker;A：正常脑组织；B：恶性星形细胞瘤组织；C：胶质母细胞瘤组织

 

3  讨论

细胞凋亡是正常组织细胞精细调节的重要机制，受基因调控，其控制基因主要是通过调节细胞存活期而发挥生物效应。肿瘤细胞的凋亡易感性受多种凋亡基因表达产物相互间的作用影响，各种凋亡因子与肿瘤的形成密不可分^[6]。bcl-2蛋白是bcl-2家族中重要的凋亡抑制基因，主要通过稳定线粒体膜电位，阻止细胞色素C和凋亡抑制因子的释放，阻断Caspase酶活化的上游信号传递通路等作用，抑制细胞凋亡的发生，最终导致细胞恶变^[7，8]。研究证实：bcl-2在多种肿瘤组织细胞中高表达，它的异常表达可使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡，参与肿瘤的形成^[1，5]。在本实验中，我们发现胶质瘤组织中普遍存在bcl-2高表达，明显不同于正常脑组织（P <0.01）。说明bcl-2基因可能参与了胶质瘤细胞凋亡的调节，在胶质瘤中促进肿瘤生长的表达性反应，可能是导致胶质瘤形成的一个重要因素。

胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，由于其多质性和浸润性的特点，手术切除难以完全彻底，放射治疗不十分敏感，化疗多有产生耐药，因此，复发率高，预后差是目前临床治疗的世界性难题。bcl-2在胶质瘤中的高表达性反应，给胶质瘤的治疗带来了新的思路。已有研究发现，bcl-2高表达提高了肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，通过促进基质蛋白酶的合成、分泌和活化提高了恶性肿瘤浸润性生长的能力^[9，10]。本研究，61例胶质瘤组织中bcl-2 蛋白和bcl-2 mRNA阳性率和表达强度随肿瘤恶性程度增加而增加，特别在Ⅲ级组和Ⅳ级组更为明显，这一实验结果与本组病例临床资料、手术所见和随访结果相符合，与文献报道一致^[11]。同时，对比免疫组化和原位杂交还发现，bcl-2 蛋白表达强度和bcl-2 mRNA表达强度在等级间是呈一个显著的正相关系，且在转录水平上的表达量显著高于蛋白翻译水平（P <0.01）。此外，也发现在部分Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤组织中，不论是采用免疫组化还是原位杂交均显示有bcl-2异常高强度表达，结合再次多点病理，验证了胶质瘤多质性的存在。说明在恶性胶质瘤组织中bcl-2的高表达与肿瘤恶性进展及浸润性生长能力的获得密切相关，与临床预后呈显著负相关，进一步揭示了胶质瘤细胞凋亡/存活的机制，这有可能成为恶性胶质瘤凋亡治疗的新靶点和克服胶质瘤化疗耐药性的新途径。