儿童髓母细胞瘤组织中Bcl-XL mRNA和蛋白的表达及其临床意义

[摘  要]  目的  研究bcl-xL基因在正常脑组织和儿童髓母细胞瘤组织中的表达及其表达水平和意义。方法  应用免疫组化染色和原位杂交方法对41例儿童髓母细胞瘤（其中复发性肿瘤11例）和20例正常人脑组织中bcl-xL蛋白和bcl-xL mRNA表达水平进行检测，并与临床资料和预后进行比较。结果  儿童髓母细胞瘤组织中免疫组化染色90.2%（37/41）表达bcl-xL蛋白；原位杂交显示95.1%(39/41)表达bcl-xL mRNA，两者呈正相关。正常人脑组织bcl-xL表达水平和强度显著低于髓母细胞瘤(均P<0.01)。复发性肿瘤表达水平和强度显著高于非复发肿瘤(均P<0.01)，且98%的复发性肿瘤首次治疗时均出现肿瘤与第四脑室底的浸润。结论  凋亡抑制基因bcl-xL在儿童髓母细胞瘤的恶性进展中发挥重要作用。bcl-xL表达水平和强度和首次发病时与第四脑室底的浸润是儿童儿童髓母细胞瘤的重要预后因素。 郑州大学第五附属医院神经外科王新军

[关键词] 髓母细胞瘤；bcl-xL基因；免疫组织化学；原位杂交；儿童

Expression  Level  and  Clinical  Significance  of  Bcl-XL  Gene  in Childhood  Medulloblastoma   

Wang Xin-jun  Department of Neurosurgery,the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University Zhengzhou  450052 , China

Abstract: Objective  To discussion the  expression level and clinical significance of bcl-xL gene  in childhood medulloblastoma.  Methods  The expression of bcl- xL protein and bcl- xL mRNA  are  determined by immunohistochemical staining method and in situ hybridization in 41 samples of  medulloblastoma tissues, as well as 20 normal brain tissues.  Results  The positive rates of bcl- xL protein(90.2%) and bcl xL mRNA (95.1%) in medulloblastoma group is significantly higher than those in human normal brain tissues(P<0.01), and there is a close correlation between bcl- xL protein and bcl xL mRNA expression level (P<0.01).   The bcl- xL protein and bcl- xL mRNA expression level in medulloblastoma group is significantly higher than those in human normal brain tissues (P<0.01). Recurrenct group is significantly higher than those in   primary  group.(P<0.01).Conclusion  Bcl- xL gene plays an important role in the childhood medulloblastoma apoptosis,and it’s expression level can be  a close correlation with progressive  development. As in childhood medulloblastoma patients,the evidence of  high expression of Bcl-xl  and primary infiltration of the floor of the fourth ventricle  is an important prognostic factor.

Key words: Medulloblastoma；Bcl-xL；immunohistochemical ；in situ hybridization

   儿童髓母细胞瘤是中枢系统常见的儿童恶性肿瘤，尽管采取了手术、放疗和化疗的综合治疗，但因为恶性程度高，易复发且死亡率高日益受到重视。Bcl-xL基因是Bcl-2基因家族的一个重要的凋亡抑制基因，近年来人们发现，Bcl-xL基因的过表达及其磷酸化参与细胞凋亡的调控，并且在多种肿瘤的形成和肿瘤的多药耐药中起着至关重要的作用，但涉及髓母细胞瘤的研究很少。本研究采用免疫组化染色和原位杂交的方法对儿童髓母细胞瘤组织和正常脑组织中bcl-xL表达进行检测和比较，并结合临床资料和预后进行相关分析，来探讨bcl-xL在儿童髓母细胞瘤疾病进展中的作用，现将结果报道如下。

材料与方法

一、 病例与组织标本来源   收集我院2001年1月到2005年12月手术切除的新鲜髓母细胞瘤标本41例，其中男23例，女18例，年龄3.7～15岁，平均8.1±2.4岁。全部标本均经病理确诊。另随机选取20例同期颅脑损伤患者手术获得的无神经系统肿瘤的正常脑组织标本作正常对照,对照组男性17例，女性3例，年龄11～37岁，平均22.7±2.9岁。标本收集时，取中心部位无出血坏死组织，一部分用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片备用。另取部分立即用冷冻包埋剂(OCT)包埋，液氮快速冷冻，-70℃冰箱保存用于提取RNA。在41例肿瘤标本中，术前未经任何治疗的原发首次手术30例，复发性手术切除标本11例。

二、bcl-xL蛋白的免疫组织化学染色  兔抗人bcl-xL蛋白多克隆抗体购于博士德生物工程公司，SP法免疫组织化学染色试剂盒购于北京中山生物技术公司。实验过程严格按照随试剂所附的说明要求操作进行。组织切片经常规脱蜡、水化后，放入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中预处理，经微波加热（92～98℃）10 min，冷却到室温后用羊血清封闭，滴加一抗工作液（1∶50），PBS冲洗，DAB显色。用已知阳性表达切片做阳性对照，用正常羊血清代替一抗作阴性对照。结果判定：背景无颜色，胞浆内着棕黄色颗粒为阳性细胞。（?）没有阳性信号；（?）弱阳性，阳性细胞≤25%；（??）弱阳性，阳性细胞介于25%-50%；（???）强阳性，阳性细胞50%-75%；（????）强阳性，阳性细胞＞75%。

三、bcl-xL mRNA原位杂交   经地高辛标记的bcl-xL探针及检测试剂盒均购自北京奥克公司。检测程序均严格按该试剂盒说明进行，组织切片经常规脱蜡、水化，预处理后，蛋白酶K消化30min,预杂交24h,加入5-10ng的地高辛杂交液40ml，42℃杂交36h,加入抗地高辛抗体，37℃孵育，DAB显色。空白对照加不含bcl-xL探针的杂交液作为阴性对照。结果判定：背景无颜色，胞浆和胞膜内着紫蓝色颗粒为阳性细胞，判定同上。

四、统计学处理   采用SPSS10.0对相应数据进行Ⅹ²检验、t-检验、F-检验及直线相关分析和等级相关分析，以P<0.01作为检验水准。

结果

一、bcl-xL蛋白的免疫组化染色结果   在41例瘤组织中，有37例(90.2%)bcl-xL蛋白普遍高表达，且多呈强阳性，在正常脑组织中仅3例（15.0%）表达bcl-xL,且为弱阳性，两组之间存在显著差异（x²=27.38, P<0.01）。在11例复发肿瘤组全部以强阳性表达，与正常组织相比，具有高度显著性差异（P<0.001）。bcl-xL蛋白阳性细胞弥漫于细胞浆和细胞膜中呈棕黄色，阳性肿瘤细胞呈散在分布（结果见表1）。

表1  bcl-xL 蛋白在正常脑组织及髓母细胞瘤组织中的表达

组别        总例数  阳性数（%）	强度例数（%）
	?        ??        ???      ????
正常脑组织  20      3(15.0)       2(66.7)   1(33.3)  0           0 髓母细胞瘤  41     37(90.2)       0         1(2.7)   6(16.2)    30(81.1) 复发肿瘤组  11     11(100.0)      0         0        1(18.2)    10(90.9)

注：t检验组间P<0.01

二、原位杂交结果  bcl-xL mRNA阳性肿瘤细胞细胞浆和细胞膜内着紫蓝色颗粒，均匀着色，阳性肿瘤细胞呈不均匀分布(见图2)。41例髓母细胞瘤组织中，39例强阳性表达bcl-xL mRNA。而20例正常脑组织中只有3例表达，且仅为弱阳性表达，两组bcl-xL mRNA 表达水平存在显著差异（x²=30.21, P<0.001），复发肿瘤组全部以强阳性表达见表2。

表2    原位杂交检测bcl- xL mRNA 表达结果比较

组别        总例数  阳性数（%）	强度例数（%）
	?        ??        ???      ????
正常脑组织  20      3(15.0)       2(66.7)   1(33.3)  0           0 髓母细胞瘤  41     39(95.1)       0         1(2.5)   4(10.3)    34(87.2) 复发肿瘤组  11     11(100.0)      0         0        1(18.2)    10(90.9)

注：t检验组间P<0.001

三、髓母细胞瘤组织中bcl-xL蛋白与bcl-xL mRNA之间的关系    从Bcl-xL在蛋白质水平和转录水平表达结果比较看，基因转录水平的表达显著高于蛋白质水平的表达，经等级相关分析证实，bcl-xL mRNA在蛋白水平表达与基因转录水平的表达强度等级之间呈显著一直性正相关(r_s=0.995,P<0.001)见表3。

表3   bcl- xL在蛋白质水平和转录水平表达结果比较

组别     例数   总阳性数（%）	强度例数（%）
	?      ??          ???       ????
免疫组化    41   37(90.2)   0        1(2.7)   6(16.2)    30(81.1) 原位杂交    41   39(95.1)   0        1(2.5)   4(10.3)    34(87.2)

 

图1、正常脑组织中bcl-xL的表达，S-P法D×200，(DAB染色，苏木素复染)

图2、图3分别是髓母细胞瘤和复发性儿童髓母细胞瘤中bcl-xL的表达，阳性肿瘤细胞胞浆呈棕黄色，阳性肿瘤细胞呈分散分布，S-P法D×400，(DAB染色，苏木素复染)

图4、儿童髓母细胞瘤中bcl-xLmRNA的表达，阳性肿瘤细胞呈紫蓝色，位于胞浆和胞膜，阳性肿瘤细胞呈不均匀分布，原位杂交×400，(DAB染色)

讨论

   人体各组织细胞数目的维持是由细胞增生与死亡之间的平衡来实现的，如果细胞增生速度加快或/和死亡速度减慢，都可引起体内细胞异常增多，导致肿瘤的发生，研究已证实细胞凋亡的抑制是肿瘤形成过程中最关键的一步^[5]。bcl-xL基因是bcl-2家族中重要的凋亡抑制基因，位于细胞线粒体膜上，主要通过稳定线粒体膜电位，阻止细胞色素C和凋亡抑制因子的释放，阻断Caspase酶活化的上游信号传递通路等作用，打破细胞的自稳平衡机制，使得受损或突变细胞不能得到及时清除，并在增生基因和生长抑制基因的协同作用下，导致细胞恶变，最终发展为肿瘤^[6]。bcl-xL在多种肿瘤组织细胞中的异常表达可使已有基因异常改变的细胞逃避凋亡，参与肿瘤的形成^[3，5，7]。本实验结果证实在正常脑组织中bcl-xL低表达，而儿童髓母细胞瘤组织中bcl-xL普遍高表达，这说明bcl-xL基因参与了髓母细胞瘤形成，可能是导致髓母细胞瘤发生的一个重要前提。Sharma等^[8]研究已证实bcl-xL在头颈鳞状细胞瘤和淋巴瘤中的高表达于其临床恶性进展关系密切。在本实验中我们还发现：不论是免疫组化还是原位杂交，髓母细胞瘤组织中bcl-xL均高表达强反应，与正常脑组织存在显著差异（P <0.01）。且在bcl-xL的这种在儿童髓母细胞瘤中促进肿瘤形成的表达性反应，说明bcl-xL基因参与了髓母细胞瘤的细胞凋亡调节，提示bcl-xL在髓母细胞瘤恶性进展过程中起重要促进作用。通过与复发肿瘤组的对比研究进而发现，复发组bcl-xL一致的强阳性表达，表明bcl-xL在儿童髓母细胞瘤术后复发中起一定促进作用。

   髓母细胞瘤是颅内恶性胶质瘤的一种，儿童发病率约占小儿所有脑肿瘤的20％，且以13-15岁儿童多见。此肿瘤细胞生长极其活跃，呈浸润性生长，有沿脑脊液播散、种植的倾向，且多生长于小脑蚓部，部分侵及脑干，开颅手术难以切净病灶，化疗多数患者耐药，放疗敏感但有可能严重损害儿童智能，即使术后放疗多数病人仍复发率高，再手术更加困难，患者生存期短预后不良是目前临床治疗的一大难点[9]。对比免疫组化和原位杂交我们还可以发现，41例髓母细胞瘤组织中，bcl-xL 蛋白和bcl-xL mRNA阳性率和表达强度在等级间是一致的，且基因水平表达量显著高于蛋白水平的高表达。进一步将这一实验结果与本组病例临床治疗、术中所见情况及随访资料进行比较发现：bcl-xL高表达与术中肿瘤侵润性、术后化疗耐药和临床生存期短关系密切；肿瘤的复发与bcl-xL强表达和首次发病时与第四脑室底的浸润存在密切关系。表明bcl-xL高表达可以通过促进基质蛋白酶的合成、分泌和活化来提高髓母细胞瘤浸润性生长能力,可以提高该肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，直接影响预后^[10,11]；bcl-xL表达水平和强度和首次发病时与第四脑室底的浸润可以作为儿童儿童髓母细胞瘤治疗的重要预后指标。

   此外，髓母细胞瘤组织中普遍存在着基因转录水平和蛋白质翻译水平上bcl-xL的一致性过度表达，表明bcl-xL能通过一定机制抑制髓母细胞瘤的细胞凋亡，与肿瘤的发生、恶性进展及浸润性生长能力的获得和复发密切相关。对这种机制的进一步研究，有可能通过调节bcl-xL的表达来促进髓母细胞瘤的细胞调亡，克服化疗耐药，提高放疗敏感性，从而达到治疗肿瘤的目的。