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- HBV感染患者肝移植术后HBV再感染及其机理
- 作者:方清|发布时间:2012-10-25|浏览量:836次
《中华肝脏病学杂志》
方清1、3赵连三1※周陶友1刘隽2刘丽1 卢实春2
1 四川大学华西医院感染病中心教育部人类疾病生物治疗重点实验室 成都610041
2 四川大学华西医院肝胆外科
3 湖北省宜昌市中心人民医院 宜昌市中心人民医院肝病科方清
※ 通讯作者
【摘要】 目的 随访乙肝病毒(HBV)感染患者肝移植术后HBV再感染的发生情况,探讨外周血单个核淋巴细胞(PBMC)内HBV DNA的存在状态与再感染的关系。对象与方法 随访30例HBV感染相关性肝移植患者,包括晚期肝炎肝硬化18例,原发性肝癌7例,重症肝炎5例。均于肝移植术前2周内或术后立即给予拉米呋啶(lamivudine 100mg/d),部分患者还联用高效价乙肝免疫球蛋白(HBIG)。术后平均随访时间为19个月(6月~52月),对术后不同时期采集的PBMC标本进行HBV DNA检测,并通过自建的PCR检测体系对部分HBV DNA检测阳性标本进行了HBV cccDNA检测。结果 (1)本组所有患者在患肝摘除后2周时,血清HBV感染标志物HBsAg、HBeAg、HBcAb IgM和HBV DNA等均检测结果阴性。在此后的随访期间,8例患者的血清HBsAg和HBV DNA阳转,肝移植术后1年、2年、和3年的HBV再感染率分别为11.3%、34.85%和58.36%。(2)本组96.7%(29/30例)的患者均在PBMC内检出HBV DNA。(3)上述患者的PBMC内未检出HBV cccDNA的存在。 结论 尽管采取防治HBV再感染的措施(例如使用拉米呋啶和HBIG等),HBV感染者肝移植术后HBV再感染仍未获完全控制。肝移植术后的PBMC内可以检出HBV DNA,但作者没有检测到HBV cccDNA的存在,提示PBMC是导致HBV再感染的肝外病毒库之一,但可能仅仅是HBV的寄存处,而并非HBV的复制场所。
【关键词】肝移植;乙型肝炎病毒,;HBVcccDNA,外周血单个核细胞,PBMC
Re-infection and Its possible Mechanism for Liver-transplanted Patients Related with HBV Infection
FANG Qing,ZHAO Lian-san,ZHOU Tou-you,LIU Jun,LIU Li,LU Shi-chun Department of Infection Diseases Center, Key Laboratory of Biotherapy of Human Diseases of Ministry of Education,P.R.C,West China Hospital of Sichuan University, Chengdu Sichuan Province, China,610041
Corresponding author: ZHAO Lian-san, Department of Infection Disease Center, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan Province, China
【Abstract】Objective Research on the existing situation of HBV in PBMC of post-liver transplant chronic virus hepatitis B patients, we explore the relationship between HBV infection within PBMC and HBV reinfection. Material and Methods Blood specimens taken from 30 following recipients intermittently after liver transplantation, all the recipients received lamivudine monoprophylaxis or combined with HBIG. HBV DNA in serum and PBMC were detected by Fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR)respectively. And partial PBMC samples with high HBV DNA loading were subsequently assayed for HBV cccDNA by a new established selected PCR system with high specificity and efficacy to discriminate HBV cccDNA.The experimental results were collected and analyzed with clinical data .Results (1) the overall 1-year、2-year and 3-year rates of HBV reinfection in this group were 11.3%、34.85% and 58.36%, respectively.(2) 96.7%(29/30) patients were detected the presence of HBV DNA in their PBMC. (3) No HBV cccDNA positive result were gained in 32 PBMC samples with high HBV DNA burden (>106 copies/ml cell disruption).Conclusion Those findings indicated the HBV DNA in PBMC could persist for a long-term in general recipients despite protective measures being taken for prevention HB recurrence, but no evidence for HBV replication in PBMC, and PBMC maybe play an important role in transmission HBV partical from other extrahepatic HBV infection tissues to allograft.
【Key words】Hepatitis B virus; Liver transplantation; HBV reinfection; PBMC; HBVcccDNA
肝移植已经成为终末期肝脏疾病的一个重要治疗手段。但是,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相关性肝病患者肝移植术后,乙型肝炎的复发率达70%-80%,严重地影响了肝移植术的远期效果,成为亟待解决的一个问题[1]。作者在对肝移植患者HBV再感染随访观察的基础上,采集了外周血单个核淋巴细胞(PBMC)标本,通过PCR技术,对其进行了HBV DNA定量检测和HBV cccDNA的定性检测,对肝移植术后患者HBV再感染的状况及其机理进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 一般资料
自1999年5月-2002年11月间接受了原位肝脏移植的30例患者,均来自四川大学华西医院肝脏移植中心。其中,男29例,女1例,年龄28-57岁,平均39.8岁。术前基础疾病包括晚期肝炎肝硬化18例,原发性肝癌7例,重症肝炎5例,均经术后病理检查确诊;术前乙肝病毒感染血清学检测均系血清HBsAg、抗HBc阳性;其中,22例同时为HBeAg阳性和/或HBV DNA阳性(占全部病例的73%)。
30例患者的供肝经过术中活检,免疫组织学病理检查均显示HBsAg(-)和HBcAg(-);HCVAg(-)。手术住院期间使用的血制品均经检测证实HBV感染标志物阴性。所有病例术后存活时间均在半年以上。为防治HBV再感染,患者均在术前2周内或术后立即开始口服拉米呋啶100mg/d,持续维持;部分患者术后间断使用了高效价乙肝免疫球蛋白。
1.2 标本采集
共收集上述病例术后不同时期(术后2月-52月)的血标本,每份均采全血10ml,其中8ml经肝素抗凝用于PBMC分离,另2ml用于血清分离。此外,从2例无HBV感染的健康志愿者采集了血标本作为阴性对照。
1.3 PBMC分离与洗涤
全血标本加入等量PBS(0.01M磷酸盐缓冲液,pH 7.2)混匀,沿管壁缓缓加在1/2V的淋巴细胞分离液面上,置水平离心机离心,2200rmp×20min。小心吸取界面层的细胞悬液移入另管,并加入PBS溶液混匀洗涤所获细胞,离心2000rmp×10min后,弃上清。同法洗涤细胞3次,PCR检测最后一次洗涤液上清为HBV DNA阴性,始视为洗涤合格。
收获的细胞沉淀物采样加3%冰乙酸溶解混入的红细胞后,以血球计数板计数PBMC。根据计数结果,加PBS调整细胞浓度至1×107/ml,保存于-70℃。
1.4 荧光定量PCR(FQ-PCR)检测HBV DNA
取-70℃储存的PBMC和血清样本,解冻后送检。按照试剂盒(中山医科大学达安基因诊断中心产品)说明书操作,取上述标本各40µl,采用自动荧光PCR仪(美国Applied Biosystems 7700)进行检测。
同时设立对照组,PCR操作完成后,阳性、阴性对照的HBV DNA检测结果符合预期时,始认可为合格检测。包括:阳性对照:血清HBV DNA检测阳性的慢性HBV感染者的PBMC标本;阴性对照:①纯水,②血清HBV DNA阴性的健康志愿者的PBMC标本。
1.5 ELISA检测HBV感染血清学标志物
取待测血清200 µl,按照HBVM商品试剂盒操作说明进行操作。
1.6 检测HBV cccDNA的PCR反应体系
1.6.1 PCR引物的设计与合成
采用巢式PCR设计,参照GI: X01587株HBV全基因组序列设计了3对引物,由北京赛百盛公司合成。P5、P6、P3、P4等4条引物用于PCR首轮反应,P1、P2用于次轮反应。
PCR检测HBV cccDNA引物表
名称 |
序 列 |
位 点 |
目标片段 |
片段位置 |
P5 P6* |
5′-ATGGAGAACACAACATCAGG-3′ 5′-GAGGCATAGCAGCAGGATG-3′ |
28-47 300-283 |
280 bp |
S区 |
P3 P4* |
5′-TGAATCCCGCGGACGACC-3′ 5′-GAGCTGAGGCGGTGTCGAG-3′ |
1314-1331 1881-1863 |
570 bp |
X-C区 |
P1 P2* |
5′-GTCTGTGCCTTCTCATCTGCC-3′ 5′-ACAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3′ |
1423-1443 1752-1732 |
330 bp |
X-C区 |
注:*表示反义链。P5、P6、P3、P4用于巢式PCR的首轮反应;P1、P2用于次轮反应。
1.6.2 PCR反应
采用PE2400热循环仪(美国Applied Biosystems公司),两轮PCR反应条件相同,均为预变性94℃5min,94℃30秒,55℃30秒,72℃30秒,共35个循环,随后72℃延伸7min。取首轮反应产物5 µl作为次轮反应底物。
1.6.3 结果判定
取两轮PCR产物各5µl,琼脂糖凝胶电泳后,观察并记录结果。
设立阳性对照:①PBHB4质粒DNA稀释液(HBV DNA荧光定量为7.9×108copies /ml),PBHB4质粒含adr4型HBV全基因组[2],由本实验室唐红教授提供。②PBHB4质粒DNA稀释液和HBV DNA阴性的PBMC标本混合物。
阴性对照:①纯水,②荧光定量检测HBV DNA阴性的PBMC标本。PCR 操作完成后,阳性、阴性对照的HBV cccDNA检测结果符合预期时,始认可为合格检测。
2 结果
2.1肝移植术后HBV再感染的发生情况
本组病例平均随访19个月(6月-52月),所有患者术后2周时,血清HBV感染标志物HBsAg、HBeAg、HBcAb IgM和HBV DNA等均检测结果阴性。
以血清HBsAg和HBV DNA阳转作为临床判断发生HBV再感染的标准,随后,其中8例患者检测到HBV再感染的发生,时间分别为术后7月、9月、15月、16月、21月、31月、35月和42月。经Kaplan Meier生存表法统计分析,其中1年HBV再感染率为11.23%,2年HBV再感染率为34.85%,3年HBV再感染率为58.36%。在上述的8例患者中,2例分别在检测到再感染后的1个月和3个月死于肝衰竭;另6例在随访期间肝功能正常或轻度异常。
随术后时间演进的肝移植术后HBV再感染率如图1所示。
2.3 肝移植术后患者的PBMC内HBV DNA检测结果
在本组30例患者患者中,有1例原发性肝癌患者,其术前血清HBVDNA为阳性,术后((22月和26月共2 次的)血清及PBMC标本的HBVDNA检测结果均阴性。除此以外,29例(96.7%)术后2月-52月的PBMC内HBV DNA检测均属阳性,包括8例检测到HBV再感染的患者,和21例在随访期间血清HBsAg和HBVDNA持续保持阴性的患者。
2.4 PBMC的HBV cccDNA检测结果
2.4.1 判读HBV cccDNA的方法
首轮产物目标靶片段长度为570 bp和280 bp两条带;其中280 bp 条带的出现可以作为HBV DNA存在的标志, 570 bp条带的出现或次轮产物出现约330bp条带时,作为HBV cccDNA检测阳性结果判定标准。
2例阳性对照首轮PCR产物电泳后均可见到570bp和280bp两条带,次轮PCR产物电泳后均可见到330bp条带;而在2例阴性对照,两轮PCR产物均未见到肉眼可辨的条带。
PBMC的HBV cccDNA检测电泳结果
310bp 首轮 601bp |
310bp 次轮 601bp
|
1 2 3 4 5 6 7 8 9
注:1-6 为PBMC待检样本,7、8为阳性对照,9为分子量Marker(Xф174 DNA HaeⅢ)
2.4.2 检测HBV cccDNA的标本和结果
对荧光定量HBV DNA检测值高于1 × 106 copies/ml的25例患者的32人份PBMC标本进行了HBV cccDNA检测。13例患者的15人份标本两轮PCR扩增产物电泳均未见条带,其余12例患者的共17人份标本首轮PCR扩增产物电泳可见280bp的单一条带,均未见570bp条带;次轮产物电泳后均未见330bp条带。
此17人份PBMC标本的HBV DNA荧光定量检测值均在2.92 × 107 copies/ml-1.24 ×109 copies/ml之间。
3 讨论
3.1 移植术后供肝的HBV再感染主要源自患者的PBMC
随着外科手术学、术后处理和和抗排异手段的改进,肝移植的手术成功率及术后患者生存时间正在不断提高;然而,HBV再感染及肝炎复发却成为限制HBV感染者肝移植术治疗效果的瓶颈。尽管高效价乙肝免疫球蛋白(HBIG)和拉米呋啶等防治HBV再感染的效果已获普遍认可,并使肝移植术成为越来越多乙肝终末期患者的治疗选择,但是HBV再感染的问题仍未完全解决[1,3]。
国外资料表明,术后单用拉米呋啶(100mg/d),术后1年HBV再感染率约25%,3年HBV再感染率约40%-50% [4]。国内郑树森等报道术后单用拉米呋啶(100mg/d)防治HBV再感染,术后6个月的HBV再感染率为12.2%,术后1年的HBV再感染率为23.5%[5]。在本组的30例患者,术后均服用了拉米呋啶,部分还联用了HBIG,在患肝摘除后2周时,血清HBV感染标志物HBsAg、HBeAg、HBcAb IgM和HBV DNA等均检测结果阴性;但在此后的随访期间陆续发生了HBV再感染,术后1年、2年和3年的HBV再感染率分别11.23%、34.85%、和58.36%。
本组患者的术后1年的HBV再感染率明显低于上述报道,其可能的原因是:加强了对供肝及供血的筛选管理,杜绝或减少了外源性HBV的入侵;但是,本组的随访结果表明,尽管采取了上述措施,而且病肝也已被摘除,随着患者术后存活时间的延长,再感染率仍然逐渐上升,提示再感染主要系由患者潜藏于肝外的内源性HBV所致。由于拉米呋啶的药理机制是阻抑HBV DNA的复制,并非清除病毒;而HBV的清除有赖于机体的免疫机制,不过,肝移植术常规应用的抗排异治疗往往降低了患者的免疫清除功能,因此,即使术后均持续服用拉米呋啶,部分患者还加用了HBIG,并不能阻止HBV再感染率的发生。
HBV再感染的病毒来源有以下可能:(1)肝移植术后外周循环血浆中残留的HBV颗粒,可以归巢肝组织使供肝遭受再感染。(2)肝外组织HBV病毒库的存在,其中包括PBMC内的HBV DNA。我们的随访研究观察到: 术后2周时,全部患者的血清HBV感染标志物(HBsAg、HBeAg、HBcAbIgM和HBV DNA)等检测结果均属阴性,表明病肝摘除后2周,患者外周循环血浆中残留的HBV颗粒已降解消失,或至少低于可检出的水平。
而另一方面,术后2月-52月随访期间,对本组30例患者采集的外周血PBMC进行的HBV DNA检测表明:除一例之外,96.7%(29/30例)的患者均检出HBV DNA。这一现象显示了肝外HBV病毒库在患者体内存在的普遍性和长期性,也为移植术后HBV再感染率随术后时间延长而增加的现象提供了解释。
周思亮等报道,HBV具有全身器官的泛嗜性及病理损害的特异性,可在多种肝外器官内检出HBV DNA的存在,包括PBMC[6]。因此,肝移植术后HBV再感染的直接病毒来源,除血浆中游离存在HBV DNA外,还有通过PBMC携带经血液循环直接到达肝脏的可能性。
肝移植患者PBMC内检测到的HBV DNA来源存在以下可能:(1) PBMC外源性摄取的HBV颗粒。(2) PBMC内本身存在的HBV DNA复制。(3) PBMC基因组内整合形式存在的HBV DNA。可以基本排除PBMC洗涤不净造成的血浆HBV颗粒物理吸附的可能性。
感染PBMC的HBV是否可在其内进行HBV DNA复制,目前尚存在争议。如果存在HBV DNA的复制,则PBMC可以向血浆源源不断地排泌成熟的病毒颗粒,成为HBV再感染的直接源泉;否则仅仅是肝移植前原有HBV的寄存处。倘若后者属实,经摘除原有的感染肝,并给予有效的抗病毒药物,而且术后持续治疗的疗程够长,足以超越PBMC及HBV DNA的寿命;那么,机体原有的肝外残留HBV应能全部降解清除。换言之,阐明PBMC内是否存在HBV DNA的复制,可对肝移植患者术后的HBV再感染的防治策略提供理论指导。
3.2 PBMC成为HBV的寄存库,但可能不是复制场所
HBV的基因组是一种松弛环状的双股DNA分子(relaxed circular DNA,rcDNA);其正负股上各有一小缺口,形成部分开环的结构。在HBV DNA开始复制时,缺口被补齐形成完整的环状,即共价键闭合环状DNA分子(convalently closed circular DNA,cccDNA)。HBV cccDNA的结构稳定,半衰期长,不能被现有的抗病毒药物直接清除,成为HBV感染难于被彻底根治的症结[7,8]。感染肝脏细胞后,HBV rcDNA进入细胞核转变为cccDNA是病毒复制的第一步,因此,HBV cccDNA的检出是病毒复制的依据。HBV cccDNA的检测方法有PCR方法和Southern blot方法两种。由于Southern blot法所需标本量大,临床难于满足,目前对PBMC内cccDNA检测主要采用PCR方法。
利用PCR技术,Cabrerizo M等报告在血清HBsAg阴性的恢复期急性HBV感染患者的PBMC内曾检测到HBV cccDNA[9]。Torii N等在急性HBV感染恢复者和慢性HBV感染患者的PBMC内曾检测到HBV cccDNA[10]。
参照Stoll-Becker等的技术[11],我们建立了一种HBV cccDNA检测体系。该体系在巢式反应首轮中增加一对引物扩增HBV S基因保守区片段,以作为检测体系的内参照。
经对32人份PBMC标本(经荧光定量检测HBV DNA浓度均在1×106 copies/ml以上,最高达1.24 × 109 copies/ml)进行了HBV cccDNA的检测。在其中12例患者的共17人份标本中,可检出HBV DNA,但均未检测到HBV cccDNA。这就表明,在本组患者的PBMC内,难以检出HBV cccDNA的存在,尽管他们(96.7%,29/30例)的PBMC内均检出了HBV DNA。
另一方面,Kock等用PCR法对慢性HBV感染者的PBMC进行的cccDNA检测,结果为阴性[12]。刘茂昌等采用定量PCR方法对49例慢性HBV感染者的PBMC进行检测,亦未检测到HBV cccDNA[13]。
对HBV cccDNA的研究已经引起了广泛的兴趣,出现了上述不同的检测结果。有报道甚至在血清中也检测到了游离的HBVcccDNA[14];然而,理论上HBVcccDNA应存在于宿主细胞核内。对于造成结果不一致的可能原因需要进行深入分析。不过,首先需要考虑的是,采用PCR方法检测HBVcccDNA存在一个固有的技术困难, 即HBVrcDNA 在PCR扩增中,可能形成粘附片段,从而容易造成假阳性结果(将另文详加讨论);
Stoll-Becker等采用巢式PCR首先在HBV感染的肿瘤患者的PBMC内曾检测到HBV cccDNA[9]。我们的研究参照Stoll-Becker等的技术并加以改良,在检测体系中设置了内参照,成为PCR方法的一个质量控制因素,保障了PCR反应的可靠性。但是,在本组患者的PBMC内,尽管HBV DNA检测阳性,却仍然难以检出HBV cccDNA的存在。这一结果虽然尚不能绝对排除PBMC内HBV cccDNA存在的可能性,但至少提示在肝移植术后患者的PBMC内,HBV cccDNA的拷贝数低于可检测的水平;换言之,并不存在HBV DNA的活跃复制。
从另一角度而言,倘若PBMC内存在病毒活跃复制,就会向血清排泌HBV DNA而被普遍检出,而且应在供肝尚未被感染前就应被很早检出。但事实上,在本组30例患者中,虽有29例的PBMC内HBV DNA检测阳性,而可同时检出血清HBV DNA者仅为很少数(不过8例而已);而且,这8例中血清HBV DNA最早检出的时间迟至术后7个月。这些现象亦不支持PBMC内存在病毒活跃复制。
Tang等的研究显示,肝细胞内存在一类特异的细胞因子-??肝富集因子,HBV的复制必须有赖于肝富集因子的参与[ 15]。可能正是由于PBMC内缺乏肝富集因子,导致HBV DNA在其内复制困难。根据本研究所获得的上述结果, PBMC可能是导致HBV再感染的肝外病毒库之一,但PBMC仅仅是HBV在肝外的寄存库,而可能不是复制的场所。作者认为,研发新的效果更强有力的抗乙肝病毒药物,并在术后使用足够长的疗程直至PBMC内的HBV DNA完全降解,应是预防肝移植术后再感染的关键途径。此外,对肝外其它组织中是否存在HBV DNA的复制场所,亦有必要进行深入研究。
参 考 文 献
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