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- 风湿性心脏病心肌中核转录因子的表达及其意义
- 作者:任崇雷|发布时间:2013-06-20|浏览量:1168次
风湿性心脏病心肌中核转录因子的表达及其意义
expression and significance of nuclear transcription factor in myocardium of rheumatic heart disease
任崇雷 刘维永 张近宝 北京301医院心血管外科任崇雷
ren chong-lei*, liu wei-yong, zhang jin-bao. *department of cardiovascular surgery, the 466th hospital of pla, beijing 100089
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870790)
作者单位:100089 北京,解放军第四六六医院心血管外科 [任崇雷(现在解放军总医院心血管外科) ],第四军医大学西京医院心血管外科(刘维永、张近宝)
通讯作者:任崇雷 100853 北京市复兴路28号解放军总医院心血管外科 e-mail:renchl70@sina.com; renchl70@hotmail.com
风湿性心脏病心肌中核转录因子的表达及其意义
[摘要]目的 了解风湿性心脏病患者心肌中核转录因子表达的特点,探讨核转录因子与风湿性心脏病心肌纤维化的关系。方法 风湿性心脏病病人30例,术中取左室乳头肌,成年正常乳头肌10例为对照,he、masson染色检测心肌胶原;免疫组织化学方法观察核因子-kappa b(nf-kb) 、活化蛋白-1(ap-1)在心肌中的表达,均用图像分析仪定量分析。结果 风湿性心脏病心肌组织中间质胶原纤维明显增生。nf-kb与ap-1在风湿性心脏病心肌中阳性表达增强,表达强度与心肌纤维化面积呈正相关(nf-kb: r=0.8945,ap-1:r=0.9011,p<0.01),与nyha心脏功能分级呈正相关(nf-kb: r=0.7247,ap-1:r=0.7879,p<0.01);在正常心肌中表达弱阳性或阴性。结论 nf-kb与ap-1均在风心病心肌纤维化形成中起作用。
关键词 nf-kb;ap-1;心肌;胶原;风湿性心脏病
expression and significance of nuclear transcription factor in myocardium of rheumatic heart disease
[abstract] objective to investigate the effects of transcription factor nuclear factor-kappa b (nf-kb) and activated protein-1 (ap-1) on rheumatic myocardial fibrosis. methods: 30 rheumatic myocardial specimens and 10 normal samples were examined by masson’s staining, immunohistochemical staining and image analysis. results: both nf-kb and ap-1 were expressed in myocardium with rheumatic heart disease (rhd), located in nuclei. the degree of positively staining in myocardium with rhd significantly correlated with the cardial collagen volume (nf-kb: r=0.8945,ap-1:r=0.9011,p<0.01) and the nyha functional classes (nf-kb: r=0.7247,ap-1:r=0.7879,p<0.01). conclusion: both nf-kb and ap-1 may play a key role in rheumatic myocardial fibrosis, a new therapeutic strategy in molecular level to prevent or regress myocardial fibrosis would be found.
[key words] nf-kb;ap-1;myocardium; collagen;rheumatic heart disease
风湿性心脏病乳头肌中核转录因子的表达及其意义
近年来的研究表明,一些核转录因子是调节细胞基因转录的关键基因,参与了机体炎症、免疫反应过程[1] 。已知炎症免疫反应在风湿性心脏病(简称风心病)心肌纤维化形成过程中起重要作用。本研究用免疫组织化学方法检测核转录因子核因子-kb(nf-kb) 、活化蛋白-1(ap-1)在风湿性心脏病左心室乳头肌中的表达,了解其分布特点及规律,探讨核转录因子在风心病胶原代谢及心肌纤维化形成中的作用及意义。
1 材料与方法
1.1 材料:病变组心肌标本(30例)取自临床确诊为风心病行二尖瓣替换术的左室乳头肌,除外合并主动脉瓣病变或冠心病者, 其中男11例,女19例,年龄23岁~54岁(40.0±10.2岁),心功能nyha分级?级6例, ?级17例, ?级7例,病史1年~30年。术前常规行心脏彩色多普勒检查和检测心功能,30例病人左室射血分数54±12%,左室舒张末径57±9.2mm,左室收缩末径36±8.4mm。对照组10例为成年尸检标本,取自意外死亡成年正常左室乳头肌,其中男女各5例;年龄25岁-50岁,平均35±10.5岁。免疫组化染色所用p65/nf-kb、c-jun/ap-1兔抗人多克隆抗体(1:400)为美国santa cruz公司产品, 兔sp试剂盒为美国zymed公司产品。
1.2 方法:病变组标本在手术中取材,成年尸检标本均在死后0.5h内取材, 40ml/l多聚甲醛固定4h-6h, 常规石蜡包埋, 连续切片厚4mm,分别做he、masson及免疫组织化学染色。免疫组织化学染色经常规脱蜡至水,双氧水封闭内源性过氧化物酶,羊血清封闭,一抗孵育4°c过夜,生物素化的羊抗兔二抗工作液及辣根酶标记链霉卵白素工作液各孵育30min,dab显色,封片,镜下观察。同时设有pbs阴性对照和抗流行性出血热病毒抗体替代对照。将he, masson及免疫组化染色切片在显微镜下随机选取5个视野,输入自动图像分析仪,定量检测心肌胶原分数表达纤维化程度、阳性细胞数表达nf-kb及ap-1的表达强度。
1.3统计处理:所有数据以均数±标准差表示,用chiss统计软件分析,组间比较用t检验,部分参数间采用线性相关分析,p<0.05为检验显著水平。
2 结 果
2.1 he染色:风心病心肌见间质纤维增生,呈网格状包绕心肌细胞和小血管,心内膜增厚,血管腔变窄或闭塞,心肌纤维肥大和萎缩并存,伴空泡变性。
2.2 masson染色:显示风心病心肌中蓝色的间质胶原纤维明显增生(图1)。图象分析结果表明,风心病心肌胶原分数明显升高(25.4±6.9),与正常人(6.9±2.1)有显著差异(p<0.01)。
2.3 核转录因子的表达:风心病心肌中成纤维细胞、血管内皮细胞及心肌细胞核内nf-kb(图2)、ap-1(图3)表达阳性,ap-1在肥大的心肌细胞阳性表达明显增强,正常成人心肌中表达弱阳性或阴性。
2.4 nf-kb、ap-1均与心肌纤维化面积程度有一定的正相关(nf-kb: r=0.8945,ap-1:r=0.9011,p<0.01;图4、5);随心功能变差而表达增强(nf-kb: r=0.7247,ap-1:r=0.7879,p<0.01;图6)。
3 讨 论
和此前的研究[2]一样,本组病变心肌组织显微结构变化揭示,胶原成分异常沉积所致心肌纤维化是风心病心肌的主要病理改变之一,心肌间质胶原纤维增生不仅呈网格状包绕肌束和心肌细胞,并可直接影响到心脏传导和收缩功能及术后疗效。
核转录因子作为信号转导途径中的一环,负责细胞内的信息交流及综合,作用于胶原基因的调控,在组织器官纤维化形成中有意义。nf-kb是近年来新发现的一种核转录因子,其作为信号转导途径中的枢纽,与多种生理、病理作用有关。已知nf-kb是由p50和p65两亚基组成的二聚体[3],静息状态下p65亚基与kb抑制蛋白(ikb)结合以失活状态存在于细胞质中,在外界因素刺激下,ikb从nf-kb二聚体上解离,nf-kb得以激活,并移位进入细胞核,与dna链上特异部位结合,启动基因转录。在此过程中,p65亚基在与ikb解离后,暴露ikb结合的位点,可以作为nf-kb的激活信号而表达[4]。本研究结果显示,nf-kb在风心病心肌中表达阳性且随心肌纤维化加重而增强,而在正常心肌中表达阴性。此前的研究已经表明,转化生长因子b1(tgfb1)等生长因子在风心病心肌表达增强,参与了风心病心肌纤维化的形成过程[5]。而shimizu等[6]报道tgfb1通过刺激转录因子如nf-kb并增加其活性而参与了心梗后心肌梗死区的心肌重构。因此nf-kb可能在tgfb1等生长因子的刺激下激活参与了心肌胶原生成的调节过程,而在风心病心肌纤维化形成中起作用。
ap-1是细胞中又一普遍存在的重要的核转录因子,属碱性亮氨酸拉链转录因子,是由fos(55kda)和jun(39kda)组成的异二聚体,通过亮氨酸拉链(leucine zipper,lz)与dna结合。许多细胞因子和生长因子基因的调控区均具有ap-1或ap-1样结合位点,它通过对靶基因的转录调控导致体内一系列生理和病理生理过程,而其本身也受到多种因素的调节。ap-1大部分由c-jun癌基因的蛋白产物组成,本研究采用c-jun/ap-1兔抗人多克隆抗体检测ap-1在心肌中的表达。研究发现,ap-1和nf-kb一样在风心病心肌中表达上调,和心肌纤维化程度呈正相关,另外ap-1还在风心病肥大心肌细胞核内阳性表达上调,提示ap-1同时刺激了心肌细胞和心肌间质细胞的胶原合成,在风心病心肌纤维化过程中起作用,导致心肌重构。其可能的机制:(1)作为tgfb诱导胶原激活转录的重要介导核因子,其通过与一定的碱基对序列结合而介导了tgfb对α2(i)前胶原促进子活性的上调作用[7]。(2)ap-1与vegf基因启动子结合后可促进其转录,与tgf-b、碱性细胞生长因子、透明质酸一起相互作用,共同促进间质细胞增生及胶原合成[8]。(3)通过调控心肌肥厚反应基因包括心钠肽、脑钠肽、内皮素1等,诱导心肌细胞肥大,引起心肌肥厚[9]。(4)与nf-kb等其它转录因子的协同作用[1]。
研究结果还显示,nf-kb与ap-1在风心病心肌中的表达强度随心功能变差而增强。由于心力衰竭时心脏可表达多种炎症因子,而许多炎症因子均利用nf-kb与ap-1通路作为其激活、产生和持续释放的机制之一。zechner等[10]发现,心力衰竭时大量产生的炎症因子如肿瘤坏死因子可使环氧合酶明显增高,其通路是经nf-kb提高的,在环氧合酶的启动子中有两个nf-kb的结合位点。因此,核转录因子不仅在风心病早期接受炎症免疫反应刺激信号调节心肌胶原的产生,参与了风心病心肌纤维化,影响了心脏功能;而且在多种综合因素导致风心病心肌重构、心功能下降后,仍通过控制多种炎症因子的释放,导致心脏功能的进一步下降。通过下调和抑制nf-kb和ap-1等核转录因子将可能为在分子水平探讨风心病心肌纤维化机制并进一步抑制和逆转风湿性胶原增生提供新思路。
参 考 文 献
1. barnes pj, adock im. transcription factor. clin exp allergy, 1995, 25:46-49.
2. 樊宏,刘维永,晏培松,等. 风湿性心脏病二尖瓣和心肌间质病理组织学及免疫组化观察. 中华医学杂志, 1996,76:183-186
3. karin m, ben-neriah y. phosphorylatin meets ubiquitination: the control of nf-kappa b activity. annu rev immunol, 2000,18:621-663.
4. kaltschmidt c, kaltschmidt b, neumann h, et al. selective recognition of the activated form and transcription factor nf-kb by a monoclonal antibody. biol chem hoppe-seyler, 1995, 376:9-16.
5. 任崇雷,刘维永,张近宝,等. 风心病乳头肌中生长因子的表达及其意义. 中华风湿病学杂志,2000,4: 274-276.
6. shimizu n, yoshiyama m, omura t, et al. activation of mitogen-activated protein kinases and activator protein-1 in myocardial infarction in rats. cardiovsc res, 1998,38:116-124.
7. chung ky, agarwal a, uitto j, et al. an ap-1 binding sequence is essential for regulation of the human alpha(i) collagen promoter activity by transforming growth factor-beta. j biol chem, 1996, 271:3272-3278
8. tischer e, mitchell r, hartman t, et al. the human gene for vascular endothelial growth factor. multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. j biol chem, 1991,266:11947-11954.
9. omura t, yoshiyama m, yoshida k, et al. dominant negative mutant of c-jun inhibits cardiomyocyte hypertrophy induced by endothelin 1 and phenylephrine. hypertension, 2002, 39:81-86.
10. zechner d, thuerauf dj, hanford ds, et al. a role for the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in myocardial cell growth, sarcomeric organization, and cardiac-specific gene expression. j cell biol, 1997, 139:115-127.
图 1 风心病心肌中胶原显著增生. masson 染色 40×10
图2 p65/nf-kb 在风心病心肌中阳性表达,定位于细胞核. 免疫组化染色 40×10
图3 c-jun/ap-1在风心病心肌中阳性表达,定位于细胞核。 免疫组化染色 40×10
图4 nf-kb在风心病心肌中表达强度(个/μm2)与心肌纤维化程度(%)的相关性
图5 ap-1在风心病心肌中表达强度(个/μm2)与心肌纤维化程度(%)的相关性
图6 nf-kb、ap-1在风心病不同心功能心肌中表达强度(个/μm2)
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