- 人脐带间充质干细胞治疗神经系统疾病的研究进展
- 作者:范存刚|发布时间:2013-06-20|浏览量:3561次
北京大学人民医院神经外科范存刚
范存刚,周景儒 综述 张庆俊★ 审校
北京大学人民医院神经外科,北京市西直门南大街44号,邮编100044
摘要:人脐带组织中富含易于分离和扩增的间充质干细胞,这些细胞生物学性质稳定,能在适宜的体内、外环境下分化为神经元和胶质细胞,移植于脑缺血、帕金森病、脊髓损伤和视网膜退行性病变的动物模型后能通过多种机制促进其神经功能恢复,现就此方面的研究进展作如下综述。
关键词:脐带;间充质干细胞;脊髓损伤;脑缺血;帕金森病
脐带是怀孕期间连接母体与胎儿之间的组织,由两条动脉、一条静脉和粘液结缔组织(沃顿胶,wharton’sjelly)构成。脐带胶、脐带血管壁和血管周围均富含基质间充质干细胞(mesenchymalstem cells, mscs)和mscs样细胞(包括基质细胞、血管周细胞等)。自mitchell等[1]首次自脐带中成功地分离出基质细胞并证实其神经分化潜能后,对脐带组织来源mscs的研究引起了广泛关注。
1.分离方法
近来,作者们通过不同的方法自人脐带的不同部位分离出具有mscs特征的细胞,并给出不同的命名。mitchell等[1]首先使用组织块培养法自脐带中分离出表达干细胞因子受体c-kit和端粒酶活性的脐带基质细胞,也有人通过胶原酶消化法分别自人脐静脉和人脐带血管周围组织中分离出mscs样细胞和血管周细胞[2,3],还有人使用混合酶(胶原酶、透明质酸酶和胰酶)消化法自人脐带沃顿胶中得到类似的细胞群[4]。有趣的是,最近有报道通过低强度脉冲超声可从脐带中成功地分离出mscs[5]。此外,friedman等[6]还介绍了将脐带沃顿胶切碎并以自体脐带血浆冻存的方法,极大地方便了脐带mscs的贮存和利用。
作者简介:范存刚(1978- ),男,硕士,住院医师,主要研究方向:干细胞移植治疗中枢神经系统疾病。
★通讯作者:张庆俊,电话010-88326468,电子邮箱zhangqjhb@yahoo.com
2.生物学特征
虽然自脐带中分离和培养mscs和mscs样细胞的方法有一定差异,所得细胞群的增殖、分化能力也不尽相同,但这些细胞通常具有如下特征:⑴贴壁生长,呈长梭形,有时可混有小圆细胞或扁平细胞。⑵可形成成纤维细胞集落形成单位。⑶80%以上的细胞均处于g0-g1期,仅有小部分细胞进行活跃的增殖。⑷表达端粒酶活性。⑸经过多代培养或冻存、复苏后,细胞形态和增殖、分化潜能不发生显著变化。⑹能够表达cd73、cd90、cd105等公认的mscs标志物,但不表达cd34、cd45等造血干细胞标志物。⑺能在体内外分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、肝细胞样细胞、胰岛样细胞以及神经元和胶质细胞,并可通过细胞替代、分泌营养因子和调节免疫等机制修复病变组织[7, 8]。⑻表达hla-abc和hla-g,但不表达hla-dr,具有抑制免疫的能力[9]。
3.体外向神经细胞分化的潜能
3.1向神经元和胶质细胞分化
目前,已有多种方案成功地将人脐带mscs诱导为神经元和胶质细胞。mitchell等[1]先以碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growthfactor, bfgf)预处理过夜,再以多种化学诱导剂进行诱导,结果发现大部分细胞转变成神经元样细胞,并高水平地表达神经元标志物β-iii型微管蛋白和神经微丝。fu等[10]以神经元条件培养基(neuronal conditionedmedium, ncm)进行诱导,第3天时可见细胞发生形态学改变并开始表达神经元抗核抗体和神经微丝;第6天时开始表达红藻氨酸盐受体和谷氨酸脱羧酶;第9到12天时神经微丝的表达水平进一步上升并可检测到谷氨酸诱发的内向电流,表明这时的细胞已转化为成熟神经元。ma等[11]发现以丹参和β-巯基乙醇诱导后的细胞表达巢蛋白、β-iii型微管蛋白、神经微丝和胶质纤维酸性蛋白。ding等[12]发现以bfgf、β-巯基乙醇、神经营养因子-3、神经生长因子和脑源性神经营养因子对克隆扩增的人脐带mscs进行诱导后约60%的细胞可表达微管相关蛋白-2,32%表达胶质纤维酸性蛋白。koh等[13]对将人脐带来源的mscs进行体外诱导后发现,约有77.4%±17.8%的细胞表达神经元特异性标志物如β-iii型微管蛋白、酪氨酸激酶受体、神经元核抗原和神经微丝-m,而表达星形细胞标志物胶质纤维酸性蛋白和少突胶质细胞标志物半乳糖脑苷脂的细胞数目则不足10%。然而,进一步的电生理检测却未发现具有功能活性的神经元型离子通道。
karahuseyinoglu等[14] 则认为人脐带基质细胞中的扁平、粗大的1型细胞对神经诱导分化方案基本无反应,而成纤维细胞样的2型细胞可被诱导分化为神经元。sarugaser等[3]也认为人脐带血管周细胞并不能分化为神经元。
3.2向特定神经元分化
研究表明,人脐带mscs不仅可分化为神经元和胶质细胞,还可分化为特定类型的神经元细胞。fu等[15]以神经元条件培养基、音猬蛋白(sonic hedgehog, shh)和成纤维细胞生长因子-8(fibroblast growth factor8, fgf-8)成功地将人脐带mscs诱导为表达酪氨酸羟化酶并分泌多巴胺的多巴胺能神经元。此外,weiss等 [16]还成功地将其诱导为表达酪氨酸羟化酶的胆碱能神经元。
4.体内移植治疗神经系统疾病
4.1.帕金森病
帕金森病是一种以纹状体多巴胺能神经元功能进行性丧失为特征的神经退行性疾病,目前尚无特异性的有效治疗方法。fu等[15]将未诱导和经过诱导的人脐带mscs移植到6-羟基多巴诱发的帕金森病大鼠模型的纹状体内,发现表达人特异性核抗原的酪氨酸羟化酶阳性细胞可在移植部位可存活达4月以上,能向移植部位的头、尾两侧迁移约1.4mm,苯丙胺诱发的大鼠转圈行为也得到显著改善。这提示人脐带mscs来源的酪氨酸羟化酶阳性细胞有望成为治疗帕金森病的理想细胞。weiss等[16]发现,细胞移植后帕金森病大鼠的黑质和腹侧被盖区内酪氨酸阳性细胞数目与大鼠的行为学改善呈正相关,并推测移植细胞产生的胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)和bfgf对多巴胺能神经元的营养作用可能是其促进神经功能恢复的主要机制。
4.2.视网膜退行性病变
各种原因引起的光感受器退行性变是致盲的重要原因之一,近来研究表明细胞移植疗法有望为该病的治疗带来新希望。应用于临床的细胞至少应满足以下条件:细胞易于获得、便于扩增、数量足够、核型稳定、无免疫原性、能够有效地恢复视觉功能。为此,lund等[17]分别将人脐带组织细胞、胎盘细胞和骨髓mscs移植到视网膜退行性变大鼠的视网膜下间隙,并以皮肤成纤维细胞作为对照。通过测定视网膜电流图、空间视敏度和亮度阈,他们发现脐带组织细胞和骨髓mscs均能显著减少视网膜退行性变,而且前者较后者对光感受器的修复作用更加显著。究其原因可能与脑源性神经营养因子(bdnf)和白介素-6的分泌有关,这无疑为视网膜退行性病变的治疗提供了新思路。
4.3.脑缺血
促进血管新生和改善神经可塑性是细胞移植治疗脑缺血的重要机制。ding等[12]将人脐带mscs移植到大脑中动脉栓塞模型大鼠的脑皮质,移植组大鼠出现:⑴躯体不对称程度显著降低,自发活动显著增加;⑵脑梗死区皮层神经元的n-乙酰天冬氨酸/胆碱及其化合物比值和n-乙酰天冬氨酸/肌酸比值显著增加;⑶缺血半暗带内可分化为表达胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白-2和神经元核抗原的细胞;⑷缺血区的巨噬细胞/小胶质细胞数目和β1-整合素的表达水平显著增加;⑸移植到缺血区对侧的细胞能通过胼胝体迁移到缺血半球并表达趋化因子受体-4;⑹缺血区微血管灌注、半暗带内神经血管密度以及缺血区皮层脑血流均显著增加,同时有趋化因子-1、gdnf和bdnf表达水平的升高。
作者认为,缺血诱发的血管内皮中趋化因子-1表达量增加及其与趋化因子受体-4之间的相互作用有助于人脐带mscs向缺血区迁移和归巢;人脐带mscs衍生的巨噬细胞/小胶质细胞和β1-整合素的相互作用及其分泌的神经营养因子能够促进血管新生和神经再生,从而改善神经功能[12]。他们还提出其修复过程可分为两个阶段:⑴在“生长因子阶段”,移植的人脐带mscs和宿主中枢神经系统的相互作用后产生的趋化因子-1、bdnf和gdnf使濒临死亡的神经元得以存活,同时减少了缺血半暗带内神经元的凋亡;⑵在“细胞修复阶段”,部分植入的细胞分化为神经元、胶质细胞和内皮细胞,从而发挥增加血流灌注和神经修复的作用[12]。
类似地,koh [13]也发现,虽然多数人脐带mscs在移植后仍保持未分化状态,但受试动物的神经功能得到显著改善,梗塞面积显著缩小,海马区表达巢蛋白的内源性干细胞数目也显著增加。这一神经保护效应可能与人脐带mscs分泌神经营养因子而发挥有关,并非是移植的细胞与宿主神经元之间建立起了新的网络联系所致[13]。
4.4.脊髓损伤
虽然大量研究表明,胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓mscs和脐带血干细胞均能在实验性脊髓损伤的修复中发挥一定作用[18],但寻找无伦理约束、易于分离、可迅速扩增、能促进神经功能恢复的干细胞一直是限制其广泛应用的瓶颈。yang等[19] 发现,将人脐带mscs移植到完全性横贯性脊髓损伤大鼠模型的损伤部位后大鼠的运动功能得到显著改善,病变周围皮质脊髓束再生轴突和神经微丝的数目显著增加,但脊髓残端的头、尾两侧的小胶质细胞和活化的星形胶质细胞数目明显低于对照组。究其原因可能与移植的人脐带mscs能在宿主脊髓内产生大量的人中性粒细胞激活蛋白-2、神经营养因子-3、bfgf、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子-3和血管内皮细胞生长因子受体-3从而促进脊髓损伤的修复有关。
5、总结
近年来,干细胞领域研究为治疗神经系统疾病带来了新希望。虽然胚胎干细胞、神经干细胞和骨髓mscs仍为研究最多、最深入的细胞类型[20],但与上述细胞相比,人脐带来源的mscs具有更多优点:⑴脐带作为分娩时遗弃的组织,无伦理道德等方面的约束;⑵原代培养即可获取大量细胞,加之细胞增殖能力强、扩增速度快,使短时间内获取大量细胞成为可能;⑶分离成功率高,几乎可达100%;⑷获取过程为非侵袭性操作,对母体和胎儿无影响,也不会造成任何痛苦;⑸细菌和病毒感染风险较成体组织来源的mscs低;⑹分化潜能介于胚胎干细胞和成体干细胞之间,既不会发生自发分化又不会无限增殖而形成畸胎瘤,又易于分化为3个胚层衍生的多种成熟细胞;⑺在适宜的体内、外环境下,能被诱导分化为多种神经元和各类胶质细胞,还能分泌大量的神经营养因子,并可通过多重机制促进各种神经系统疾病动物模型的神经功能恢复;⑻不表达mhc?类分子,低表达或不表达mhc?类分子,免疫源性低,有可能成为同种异体细胞移植的来源;⑼增殖力强,转染效率高,能稳定表达外源性基因,可作为基因治疗的载体[21]。鉴于脐带来源的mscs的上述诸多优点,我们认为它有可能在神经系统疾病的细胞治疗和基因治疗中有潜在的广泛应用前景。
参考文献
1. mitchell ke, weiss ml, mitchell bm, et al. matrix cells from wharton’sjelly form neurons and glia. stem cells, 2003, 21(1): 50-60.
2. romanov ya, svintsitskaya va, smirnov vn. searching foralternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidatemsc-like cells from umbilical cord. stem cells, 2003, 21(1): 105-110.
3. sarugaser r, ennis j, stanford wl, et al. isolation, propagation, andcharacterization of human umbilical cord perivascular cells (hucpvcs). methods mol biol, 2009, 482: 269-279.
4. seshareddy k, troyer d, weiss ml. method to isolate mesenchymal-like cellsfrom wharton"s jelly of umbilical cord. methods cell biol, 2008, 86: 101-119.
5. yoon jh, roh ey, shin s, et al. introducing pulsed low-intensityultrasound to culturing human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.biotechnol lett, 2009, 31(3): 329-335.
6. friedman r, betancur m, boissel l, et al. umbilical cord mesenchymal stemcells: adjuvants for human cell transplantation. biol blood marrow transplant,2007, 13(12): 1477-1486.
7. karahuseyinoglu s, cinar o, kilic e, et al. biology of stem cells in humanumbilical cord stroma: in situ and in vitro surveys. stem cells, 2007, 25:319-331.
8. troyer dl, weiss ml. wharton"s jelly-derived cells are a primitive stromalcell population. stem cells. 2008, 26(3): 591-599.
9. weiss ml, anderson c, medicetty s, et al. immune properties of humanumbilical cord wharton"s jelly-derived cells. stem cells, 2008, 26(11):2865-2874.
10. fu ys, shih yt, cheng yc, et al. transformation of humanumbilical mesenchymal cells into neurons in vitro. j biomed sci, 2004, 11(5):652-660.
11. ma l, feng xy, cui bl, et al. human umbilical cord wharton"s jelly-derivedmesenchymal stem cells differentiation into nerve-like cells. chin med j(engl). 2005, 118(23): 1987-1993.
12. ding dc,shyu wc, chiang mf, et al. enhancement of neuroplasticity through upregulationof beta1-integrin in human umbilical cord-derived stromal cell implanted strokemodel. neurobiol dis. 2007, 27(3): 339-353.
13. koh sh, kim ks, choi mr, et al. implantation of human umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells as a neuroprotective therapy for ischemicstroke in rats. brain res, 2008, 1229: 233-248.
14. karahuseyinoglu s, kocaefe c, balci d, et al. functional structure ofadipocytes differentiated from human umbilical cord stroma-derived stem cells.stem cells, 2008, 26(3): 682-691.
15. fu ys, cheng yc, lin my, et al. conversion of human umbilical cordmesenchymal stem cells in wharton"s jelly to dopaminergic neurons in vitro:potential therapeutic application for parkinsonism. stem cells, 2006, 24(1):115-124.
16. weiss ml, medicetty s, bledsoe ar, et al. human umbilical cord matrix stemcells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodentmodel of parkinson"s disease. stem cells, 2006, 24(3):781-792.
17. lund rd, wang s, lu b, et al. cells isolated from umbilical cord tissuerescue photoreceptors and visual functions in a rodent model of retinaldisease. stem cells, 2007, 25(3): 602-611.
18. 王革生, 范存刚, 韩忠朝. 细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展. 国外医学神经病学神经外科学分册, 2005, 32(1), 5-8.
19. yang cc, shih yh, ko mh, et al. transplantation of human umbilicalmesenchymal stem cells from wharton"s jelly after complete transection of therat spinal cord. plos one, 2008, 3(10): e3336.
20. 毛更生, 只达石. 干细胞对脑胶质瘤定向迁移的研究进展. 国际神经病学神经外科学杂志, 2007, 34(1), 44-48.
21. kermani aj, fathi f, mowla sj. characterization and genetic manipulationof human umbilical cord vein mesenchymal stem cells: potential application incell-based gene therapy. rejuvenation res, 2008, 11(2): 379-386.